馬佳男，劉秋菊， 安 偉，程 飛，魏 巍

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

姜黃素亞型B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

馬佳男1，2，劉秋菊3， 安 偉1，程 飛1，魏 巍1

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

采用CCK-8比色法檢測(cè)了姜黃素(Cur)及其亞型對(duì)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK Ⅱ)的損傷作用；采用ELISA法檢測(cè)了不同濃度和時(shí)間條件下血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞Cleaved caspase-3表達(dá)的影響，并建立了糖尿病腎病細(xì)胞模型；利用此模型研究了B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制.結(jié)果表明：Cur及其亞型B13，B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞均無毒害作用；以Ang Ⅱ 250 nmol/L培養(yǎng)48 h時(shí)，可建立最佳糖尿病腎病模型.B14對(duì)Ang Ⅱ引起的HK Ⅱ細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，且此種保護(hù)作用與PI3K信號(hào)通路有關(guān).

姜黃素亞型B14；血管緊張素Ⅱ；糖尿病腎??；人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種常見的代謝紊亂性疾病.25%～40% 的糖尿病患者最終發(fā)展為糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，而糖尿病腎病常由糖尿病的微血管病變引起，是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的首要原因.[1]

血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是已知最強(qiáng)的縮血管活性物質(zhì)之一，它可引起血流動(dòng)力學(xué)變化從而造成細(xì)胞損傷.研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ造成的細(xì)胞損傷是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的主要誘因之一[2].

姜黃素(curcumin，Cur)是從姜科植物姜黃中提取的一種植物多酚，具有抗感染、抗氧化及抗腫瘤等作用.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Cur對(duì)很多疾病引起的細(xì)胞損傷及纖維化有明顯的保護(hù)作用[3].陳麗等研究證實(shí)，Cur對(duì)糖尿病大鼠腎臟病變具有明顯的防治作用[4]；梁廣等以Cur為先導(dǎo)物，設(shè)計(jì)、合成了姜黃素結(jié)構(gòu)類似物和衍生物，并對(duì)其活性進(jìn)行了檢測(cè)，其中亞型B14有明顯的抗細(xì)胞凋亡及抗腫瘤活性.[5]

本實(shí)驗(yàn)基于以上研究，探討了B14對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，以為研究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制和研制新型預(yù)防糖尿病腎病的藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK Ⅱ)、姜黃素及其亞型B13和B14由美國(guó)路易斯威爾大學(xué)醫(yī)學(xué)中心饋贈(zèng).DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；胰蛋白酶和青鏈霉素混合溶液購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑購(gòu)自Beyotime公司；Cleaved caspase-3試劑盒購(gòu)自細(xì)胞信號(hào)技術(shù)有限公司(Cell Signaling Technology Co.)；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

將HK Ⅱ細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液1次.當(dāng)鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代.

1.2.2 Cur及B13，B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞活性影響的檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK Ⅱ細(xì)胞調(diào)至 1×105個(gè)/mL后接種于3塊96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，設(shè)空白組、Cur組、B13組、B14組4組，每組6個(gè)復(fù)孔，以調(diào)零孔進(jìn)行調(diào)零比對(duì).空白組只加培養(yǎng)液；給藥組分別加2.5 nmol/L的Cur及B13，B14.然后移至37℃、含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱孵育24，48，72 h.分別取出培養(yǎng)板，采用CCK-8法測(cè)定各孔D(450)值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率.

細(xì)胞相對(duì)存活率=(D(450)給藥組-D(450)調(diào)零組)/(D(450)空白組-D(450)調(diào)零組)×100%.

1.2.3 DN模型的建立

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK Ⅱ細(xì)胞調(diào)至 1×105個(gè)/mL后接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL.依據(jù)文獻(xiàn)[5]，將100 nmol/L的Ang Ⅱ加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在不同的時(shí)間段取出，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cleaved capase-3蛋白的表達(dá)情況，以確定最佳造模時(shí)間.然后，選取不同濃度的Ang Ⅱ加入到培養(yǎng)基中，按上述最佳造模時(shí)間培養(yǎng)后取出，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cleaved capase-3蛋白的表達(dá)情況，以確定最佳給藥濃度.

1.2.4 B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK Ⅱ細(xì)胞調(diào)至4×105個(gè)/mL后接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液2 mL.然后移至37℃、含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱孵育.實(shí)驗(yàn)分為5組：空白組不給任何藥物；Ang Ⅱ組添加最佳造模濃度的Ang Ⅱ；B13組、Cur組和B14組在添加最佳造模濃度的Ang Ⅱ的同時(shí)添加2.5 nmol/L的 B13，Cur和 B14.此外，另設(shè)5組，按上述各組給藥的同時(shí)再分別添加PI3K蛋白抑制劑.以上所有各組在培養(yǎng)最佳造模時(shí)間后，分別用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量，檢測(cè)方法參照試劑盒說明書.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.兩組間差異顯著性分析用兩樣本均數(shù)差別的t檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 Cur及B13，B14對(duì)細(xì)胞活性的影響

圖1 Cur及B13，B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，Cur及B13，B14在對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞作用24，48，72 h時(shí)，細(xì)胞的存活率均大于97%，與空白組相比，無顯著性差異(P>0.05)，表明上述藥物對(duì)細(xì)胞無明顯毒害作用，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究.

2.2 DN模型結(jié)果

Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)變化是反映細(xì)胞凋亡程度的敏感指標(biāo)，因此，測(cè)定細(xì)胞中Cleaved caspase-3蛋白的含量可判斷細(xì)胞損傷的程度.本實(shí)驗(yàn)通過ELISA方法檢測(cè)了給予不同濃度AngⅡ、培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)Cleaved caspase-3蛋白的含量，結(jié)果如圖2、圖3所示.由圖2、圖3可見，當(dāng)AngⅡ濃度為250 nmol/L，培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，HK Ⅱ細(xì)胞Cleaved caspase-3的表達(dá)量較空白組顯著升高(P<0.05)，表明AngⅡ致HK Ⅱ細(xì)胞發(fā)生DN的最佳給藥濃度和時(shí)間分別為250 nmol/L和48 h.

2.3 B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

由圖4可見，AngⅡ組Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增加，即細(xì)胞凋亡明顯增加，與空白組相比差異極顯著(P<0.01)；而Cur組和B14組的Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量下降，細(xì)胞凋亡減少，與AngⅡ組相比差異顯著(P<0.05)，其中以B14組的細(xì)胞凋亡降低最為明顯(P<0.01)，而B13組Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量與模型組相比無明顯下降(P>0.05).這說明Cur及B14均對(duì)AngⅡ造成的HK Ⅱ細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，且以B14效果最好.

*P<0.05(vs空白組)圖2 AngⅡ處理時(shí)間對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

*P<0.05，**P<0.01(vs空白組)圖3 AngⅡ處理濃度對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞Cleaved caspase-3表達(dá)的影響

**P<0.01(vs空白組)；#P<0.05，##P<0.01(vs AngⅡ組)圖4 ELISA法檢測(cè)各組HK Ⅱ細(xì)胞Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況

*P<0.05(vs AngⅡ組)，#P<0.05(vs Cur+PI3K抑制劑組)，ΔP<0.05(vs B14+PI3K抑制劑組)圖5 PI3K抑制劑對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.4 B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制

由圖5可見，AngⅡ+PI3K抑制劑組Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量明顯升高，與AngⅡ組相比差異顯著(P<0.05)，說明PI3K信號(hào)通路的激活可抑制細(xì)胞凋亡；Cur+PI3K抑制劑組、B14+PI3K抑制劑組與Cur組、B14組相比Cleaved caspase-3表達(dá)量升高(P<0.05)，說明加入PI3K抑制劑后，Cur及B14 對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用有所下降，即Cur及B14對(duì)HK Ⅱ損傷的保護(hù)作用機(jī)制與PI3K信號(hào)通路有關(guān)；而Cur+PI3K抑制劑組、B14+PI3K抑制劑組與AngⅡ組相比Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量仍下降(P<0.05)，說明加入PI3K抑制劑阻斷PI3K信號(hào)通路后，Cur及B14 仍對(duì)細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，即Cur及B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞損傷的保護(hù)作用還與其他信號(hào)通路有關(guān).

3 討論

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是由糖代謝異常為主因所致的腎小球硬化，是糖尿病病人最重要的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率在我國(guó)呈上升趨勢(shì).目前，DN已成為終末期腎臟疾病的第二位，僅次于各種腎小球腎炎.由于DN存在復(fù)雜的代謝紊亂，一旦發(fā)展到終末期腎病，往往比其他腎臟疾病的治療更加困難，因此早期防治對(duì)延緩DN意義重大.研究發(fā)現(xiàn)，在DN中，Ang Ⅱ 可引起血流動(dòng)力學(xué)變化，其介導(dǎo)細(xì)胞因子引起的細(xì)胞凋亡也越來越為人們所重視.[2]另外，Ang Ⅱ 受體拮抗劑也被發(fā)現(xiàn)并廣泛用于治療DN[7].因此，本實(shí)驗(yàn)利用Ang Ⅱ制備腎小管上皮細(xì)胞DN模型，并通過檢測(cè)Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)確定最佳的造模濃度和時(shí)間，結(jié)果表明250 nmol/L的Ang Ⅱ 培養(yǎng)48 h可建立最佳的DN模型.

姜黃為常用中藥，具有行氣破瘀、通經(jīng)止痛、清心解毒等功效，其主要生物活性成分為姜黃素類和揮發(fā)油.其中Cur具有降血脂、抗凝、抗氧化、利膽、抗癌等作用[3].已有研究證實(shí)[4]，Cur對(duì)Ⅱ型糖尿病腎病的大鼠腎臟具有保護(hù)作用.本實(shí)驗(yàn)研究了Cur及其提取物B13，B14對(duì)腎臟的保護(hù)作用.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cur及其提取物亞型B14均可不同程度地降低Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，其中以B14效果最好.表明B14對(duì)Ang Ⅱ引起的HK Ⅱ細(xì)胞損傷具有較Cur更強(qiáng)的保護(hù)作用.

PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路，參與了不同種類細(xì)胞存活調(diào)節(jié)和抗凋亡的過程，其轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的關(guān)鍵信號(hào)分子為PI3K蛋白.PI3K本身不但具有絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性.當(dāng)接受來自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)后，可將刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡.[8]大量研究表明，PI3K/AKT可通過多種途徑發(fā)揮抗凋亡作用，被稱為經(jīng)典的抗凋亡通路.[9]研究證實(shí)[10]，PI3K-AKT-mTOR是腎臟損傷過程中關(guān)鍵的信號(hào)通路.本實(shí)驗(yàn)通過給予抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的抑制劑研究了B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入PI3K抑制劑后，B14雖仍具有對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞的保護(hù)作用，但這種保護(hù)作用的程度明顯下降，表明B14對(duì)HK Ⅱ細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與激活PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)，但并非唯一的作用途徑，有關(guān)的其他保護(hù)作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為今后DN藥物的治療提供了一個(gè)新的思路和方法.

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(責(zé)任編輯：方 林)

The protective effect and mechanism of curcumin subtype B14 to HK Ⅱ injury

MA Jia-nan1，2，LIU Qiu-ju3，AN Wei1，CHENG Fei1，WEI Wei1

(1.The College of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Urology，F(xiàn)irst Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China；3.Department of Cancer Center，F(xiàn)irst Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China)

The cell viability was detected with CCK-8 assay to observe toxic effects of curcumin(Cur) and its subtypes B13 or B14 on HK Ⅱ. Then，cleaved caspase-3 expression was detected with ELISA kit at different time and concentration of Angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ) in order to establish diabetic nephropathy cell model. Finally，the protective role and mechanism of Cur subtype B14 in the HK Ⅱ were researched with the cell model. The results showed that Cur and its subtypes B13 or B14 had no toxic effects on the HK Ⅱ cells. Diabetic nephropathy cell model could be established with 250 nmol/L Ang Ⅱ for 48 h. B14 can protect HK Ⅱ injury induced by Ang Ⅱ and this process could be associated with PI3K signaling pathway. This paper laid a foundation for researching the pathogenesis and developing new drugs of diabetic nephropathy.

curcumin subtype B14；Ang Ⅱ；diabetic nephropathy；HK Ⅱ

1000-1832(2015)04-0129-04

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2015.04.027

2015-05-03

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302860)；白求恩醫(yī)學(xué)科研支持計(jì)劃青年科研基金資助項(xiàng)目(2013205034).

馬佳男(1992—)，女，碩士研究生，主要從事泌尿外科基礎(chǔ)和臨床研究；通訊作者：魏巍(1975—)，男，博士，副教授，主要從事泌尿外科臨床研究.

R 692.6 [學(xué)科代碼] 320·2435

A