朱黎明，王 勇，黃 進(jìn)，戴愛國，羅 曼，胡 芳，張麗娟

湖南老年醫(yī)院首例恙蟲病多器官受累病例實(shí)驗(yàn)室分析

朱黎明1，王 勇2,3，黃 進(jìn)1，戴愛國1，羅 曼1，胡 芳1，張麗娟2

目的 對湖南老年醫(yī)院首例恙蟲病可疑病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速診斷及病原分子流行病學(xué)分析。方法 病人急性期及恢復(fù)期血清恙蟲病IgM、IgG抗體進(jìn)行膠體金快速定性及ELISA定量。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)病人血液及焦痂恙蟲病東方體56KD 基因及巢氏PCR擴(kuò)增熱休克蛋白基因(groEL)并分析groEL遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果 病人發(fā)熱期(發(fā)病24天)及恢復(fù)期(發(fā)病32天)血清IgM、IgG抗體定性試驗(yàn)均為陽性，ELISA定量試驗(yàn)雙份血清IgM、IgG抗體滴度均達(dá)1∶2 560。急性期血液及焦痂DNA樣本LAMP檢測及巢氏PCR擴(kuò)增groE陽性。結(jié)論 本報(bào)道為湖南老年醫(yī)院首例恙蟲病病例報(bào)道。應(yīng)加強(qiáng)立克次體病診斷及鑒別診斷。

恙蟲病;恙蟲病東方體;多器官受累;實(shí)驗(yàn)室調(diào)查

XinjiangProvince,People’sRepublicofChina)

恙蟲病(scrub typhus)是嚴(yán)重威脅亞太平洋地區(qū)公共衛(wèi)生健康的媒介源性立克次體病[1-2]。臨床以高熱、蟲媒叮咬焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大及皮疹為特征[3-4]。該病易誤診，導(dǎo)致多器官衰竭，甚至死亡[5-6]。1986年前，恙蟲病主要分布我國長江以南，此后，北方多地報(bào)道該病流行及臨床病例[7-9]。本文就湖南老年醫(yī)院首例恙蟲病臨床診斷病例實(shí)驗(yàn)室快速診斷作以報(bào)告。

1 病例調(diào)查及標(biāo)本采集患者

2014年10月20日，男性,以發(fā)熱、頭痛、伴嘔吐入院。52歲,江華瑤族自治縣人。入院系統(tǒng)檢查顯示多器官損傷。實(shí)驗(yàn)室檢查WBC升高、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿酸、乳酸脫氫酶、C反應(yīng)蛋白及血沉均表現(xiàn)升高。常見的發(fā)熱性感染性疾病包括病毒類感染、細(xì)菌性感染實(shí)驗(yàn)室檢測均為陰性。常規(guī)抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌治療無效。因病人曾有野外活動(dòng)史，查體顯示陰囊下有蟲咬焦痂?？紤]恙蟲病并給予多西環(huán)素治療，2 d后發(fā)熱停止，實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常出院。病人發(fā)熱期10月31日間采集第一份血液標(biāo)本并分離血清及血塊-20 ℃保存，同時(shí)采集焦痂組織標(biāo)本。11月10日采集恢復(fù)期標(biāo)本分離血清并送中國CDC傳染病所無形體室進(jìn)行檢測。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測分析

2.1 血清學(xué)檢測 發(fā)熱期及恢復(fù)期血清標(biāo)本同時(shí)檢測恙蟲病東方體IgM和IgG抗體?？焖俣ㄐ詸z測使用美國InBios國際有限公司快速膠體金診斷試劑(scrub typhus detectTMIgG, LOT#:NB 46/80; scrub typhus detectTMIgM, LOT#:46/81。定量試驗(yàn)使用同公司ELISA診斷試劑盒(scrub typhus detectTMIgM ELISA, LOT#:PD 1173; scrub typhus detectTMIgG ELISA, LOT#:STGS-1)。

2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)恙蟲病東方體56 KD蛋白基因 發(fā)熱期、恢復(fù)期血塊及焦痂組織DNA提取使用德國QIAGEN公司DNA提取試劑盒(Cat. No. 69506)。正常人血液及無菌水同時(shí)操作作為陰性對照；恙蟲病東方體kato型(WHO立克次體協(xié)作中心惠贈(zèng))DNA作為陽性對照。LAMP引物：FIP(5′- GTCACCGCAACATTTGCATCTG-GTAACACTGCAGGTGTGAT-3′)，BIP(5′- TACAGCAATTGAAGCATCAGGT-TCCTAAACGTAACTCGGC-3′)，F(xiàn)3(5′- TGCCRTT

TTCAGCTAGTG-3′)，B3(5′- TKGMGCRATTGTCATACC-3′)，LB(5′- AACRCTTGYCATTAACAACCGG-3′)。LAMP總反應(yīng)體積 25 μL包含有1.6 μmol/L FIP 和BIP引物, 0.8 μmol/L LF和LB 引物, 0.2 μmol/L F3和B3引物, 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),10 mmol/L KCl,8 mmol/L MgSO4, 10 mmol/L(NH4)2SO4, 0.1% 土溫-20, 0.8 mol/L甜菜堿, 1.4 mmol/L dNTP和1 μLBstDNA聚合酶 (8 U/μL)。反應(yīng)在LAMP實(shí)時(shí)濁度儀(model LA200, Teramecs, Tokyo, Japan) 63 ℃恒溫下作用 60 min， 然后 80 ℃作用5 min。 反應(yīng)產(chǎn)物以2% 瓊脂糖凝膠電泳。所有標(biāo)本獨(dú)立平行操作2次。

2.3 PCR擴(kuò)增熱休克蛋白groEL基因及序列分析 巢式PCR檢測血快及焦痂組織恙蟲病東方體groEL基因[10]。外引物Gro-1：5′- AAG AAG GA/CGT GAT AAC-3′；外引物Gro-2：5′-ACT TCA/CGT AGC ACC-3′；內(nèi)引物TF-1：5′-ATA TAT CAC AGT ACT TTG CAA C-3′；內(nèi)引物TR-2：5′-GTT CCT AAC TTA GAT GTA TCA T-3′。反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)條件按文獻(xiàn)進(jìn)行[10]。預(yù)期片段為364 bp。產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司雙向測序。應(yīng)用Blast平臺(tái)，將所測序列同源比較并用Mega5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

3 結(jié) 果

3.1 血清學(xué) 發(fā)熱期及恢復(fù)期血清膠體金定性檢測IgM和IgG抗體均陽性。ELISA定量檢測上IgM和IgG抗體滴度均為1∶2 560。

3.2 LAMP檢測 獨(dú)立平行2次LAMP檢測發(fā)熱期及及恢復(fù)期血塊及焦痂標(biāo)本,結(jié)果顯示發(fā)熱期血塊、焦痂組織呈陽性，而恢復(fù)期血塊陰性(圖1)。

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)；泳道1：發(fā)熱期血塊，泳道2：恢復(fù)期血塊，泳道3：焦痂組織，泳道4：陽性對照，泳道5：陰性對照。

圖1 LAMP檢測結(jié)果

Fig.1 LAMP results of patient’s blood DNA and eschar DNA

3.3groEl基因擴(kuò)增及序列分析 病人發(fā)熱期及焦痂組織groEl基因擴(kuò)增陽性，并且2種標(biāo)本檢出序列100%同源(328 bp)。而恢復(fù)期血液標(biāo)本檢測陰性。檢出序列暫命名為Hunan1。Blast同源比較及進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)檢出序列與泰國UT125株，Gilliam型(EF551293)，2049株，Gilliam型(EF551291)[11]、日本福島02株(KC688330)及埼玉市捕捉的大林姬鼠(Apodemusspeciosus)UAP2株(KC688329)檢出序列[12]100%同源(圖2)。此外，與我國近年北方地區(qū)如北京郊區(qū)家畜動(dòng)物山羊BJ-MY-OT-S49株(GQ499948)、家犬BJ-TZ-OT-D57株(GQ499950)、牛BJ-TZ-OT-O30株(GQ499951)及BJ-TZ-OT-O31(GQ499952)、中部安徽地區(qū)山羊AH-GD-OT-S5株(GQ499933)；AH-GD-OT-23株(GQ499934)；AH-GD-OT-22株(GQ499935)、浙江發(fā)熱病人Jin-2012株(KC485338)及Zhou-2012株(KC485340)及該地區(qū)牛ZJ-TT-OT～O21株(GQ499953)遺傳關(guān)系密切，同源性99%。同時(shí)，泰國病人UT76株(EF551292)、UT169株(EF551297)、UT219株(EF551302)、UT302株(EF551304)、UT336株(551307)、UT395株(EF551309)、UT418株(EF551310)[11]、日本Kato型分離株(AY151986)及日本大林姬鼠SH205株(KC688302)及SH245株(KC688334)[12]也歸為該基因簇。然而，本試驗(yàn)檢出序列與安徽阜陽病人FY1株(GQ468797)及北京病人BJ-PG-2008株(GQ894502)[9]遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)，后者與日本新發(fā)Kawasaki型[12](AY191587)、南朝鮮Boryong株(AM494475)遺傳關(guān)系密切。

圖2 病原體 groEL基因進(jìn)化分析

Fig.2 Phylogentic analysis based on theO.tsutsugamushigroELgene tested in the study

4 討 論

恙蟲病是嚴(yán)重威脅我國公共衛(wèi)生的重要媒介傳染病,尤其我國農(nóng)業(yè)人群存在較高的暴露風(fēng)險(xiǎn)。隨著全球氣候變化，我國恙蟲病流行疫區(qū)逐漸擴(kuò)大到全國范圍。本實(shí)驗(yàn)通過快速血清學(xué)及分子生物學(xué)診斷技術(shù)對臨床診斷病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室明確診斷。并通過序列分析確定了感染病原體的血清型為Gilliam型，這一型別在我國多地病人、家畜動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、恙螨、周邊國家如泰國、日本、緬甸等國均有報(bào)道[1,4-5]。本病例是該院首例恙蟲病報(bào)告病例，提示加強(qiáng)立克次體病診斷及鑒別診斷，盡可能降低多器官衰竭及病死率的發(fā)生，對當(dāng)?shù)匕l(fā)熱病人的救治具有重要的臨床意義。

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Laboratory investigation of the first scrub typhus case with multiorgan dysfunction in Hunnan Geriatric Hospital

ZHU Li-ming1,WANG Yong2,3，HUANG Jin1,DAI Ai-guo1,LUO Man1,HU Fang1,ZHANG Li-juan2

(1.DepartmentofGeriatricsRespiratoryMedicine,HunanGeriatricHospital410016,China;2.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China；3.CollegeofAnimalScience&Technology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,

To laboratory confirm of a clinical suspected scrub typhus with multiorgan failure in Hunnan Geriatrichospital and understand the molecular epidemiological characterizes of the pathogen tested in the study. Paired sera from the acute(24 days after onset of illness)and convalescence (32 days after illness)were tested for IgM and IgG antibodies againstOrientiatsutsugamushiby a gold conjugate-based rapid diagnostic test (RDT)and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),respectively. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) targeting the 56KD protein gene ofO.tsutsugamushiand the nested PCR targeting thegroELgene were performed respectively as the blood DNAs and the eschar DNA as temples. The IgM and IgG againstO.tsutsugamushifor sera from acute and convalescence stages were positive by RDT and the highest titer of IgM and IgGwere detected in 1∶2 560 for both of acute and convalescence stages sera. LAMP and nested PCR proved to be positive for theDNAs from acute stage blood and eschar tissue respectively.

scrub typhus;Orientiatsutsugamushi; multiorgan dysfunction; Laboratory investigation

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.019

“十二五”傳染病重大專項(xiàng)課題(No.2012ZX10004215; No.2011ZX10004-001);國家基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(973計(jì)劃)(No.2010CB530206)聯(lián)合資助,朱黎明、王勇同等貢獻(xiàn)

張麗娟， Email:zhanglijuan@icdc.cn

1.湖南老年醫(yī)院,長沙 410016; 2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,北京 102206; 3.新疆石河子大學(xué),石河子 832003

The work was supported by the National Key Science and Technology Projects of China (No.2012ZX10004215 and 2011ZX10004-001) and the National Basic Research Program of China (973 Program- 2010CB530206).

R376

B

1002-2694(2015)08-0775-03

2015-01-14；

2015-04-22