汪 敏，趙 靜，李洪連，谷素靜，馬宗斌，焦 睿

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002)

棉花黃萎病(Verticillium wilt of cotton)是一種土傳性的維管束真菌病害。該病害不僅造成棉花嚴(yán)重減產(chǎn)，而且影響纖維長(zhǎng)度和強(qiáng)度，是制約棉花優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的關(guān)鍵因素［1，2］。中國(guó)引起棉花黃萎病的病原菌主要為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)［3－5］，該病菌寄主范圍極為廣泛，可侵染 200 多種植物，而且具有傳播途徑多、防治難度大的特點(diǎn)，常常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［5］。微菌核是大麗輪枝菌的主要存活結(jié)構(gòu)和初侵染源，其形成數(shù)量與存活情況直接影響棉花黃萎病的發(fā)生程度［6，7］。微菌核是由大麗輪枝菌單根或多根菌絲經(jīng)分隔膨大、細(xì)胞壁增厚和多向芽殖形成的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，內(nèi)外層細(xì)胞的細(xì)胞壁均較厚，積累有大量的黑色素，能抵抗不良環(huán)境條件，在土壤中可存活10～15 a。在適宜條件下，微菌核受寄主根系分泌物的刺激萌發(fā)后，從植株根部侵入，并在根內(nèi)定殖和擴(kuò)展［7］。有研究表明，大麗輪枝菌的VDH1和VMK1基因與微菌核的形成密切相關(guān)［8－10］。但目前有關(guān)其微菌核形成相關(guān)基因的研究報(bào)道不多，微菌核形的分子機(jī)理尚不清楚。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)獲得大麗輪枝菌T-DNA插入突變體，從中篩選TDNA插入微菌核形成能力喪失(或減弱)的突變體，并利用高效 TAIL-PCR方法擴(kuò)增其側(cè)端序列，以期為大麗輪枝菌微菌核形成的相關(guān)基因克隆與分子機(jī)理研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及棉花品種 用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的大麗輪枝菌菌株為落葉型強(qiáng)致病力菌株FGH2，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室分離并保存［11］。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化載體pATMT1(由pCAMBIA 1300改造而成)、農(nóng)桿菌菌株 AGL-1均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室保存。大麗輪枝菌致病力測(cè)定所用的棉花品種為感黃萎病品種銀山1號(hào)。

1.1.2 主要試劑和儀器 Ex Taq酶、dNTP和限制性內(nèi)切酶、pMD19-T Vector、DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，乙酰丁香酮、卡那霉素(Kan)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，潮霉素B購(gòu)自德國(guó)Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫(kù)的構(gòu)建利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化構(gòu)建大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫(kù)，參照 MULLINS等［12］的方法，并略有改進(jìn)［11，13］。采用凍融法將構(gòu)建的載體 pATMT1轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AGL-1中，將誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌菌液與大麗輪枝菌分生孢子懸浮液涂在濾膜上共培養(yǎng)，5～7 d后挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有潮霉素的PDA平板上，進(jìn)行2次篩選，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單孢分離并保存，獲得大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫(kù)。

1.2.2 大麗輪枝菌微菌核形成缺陷的T-DNA突變體篩選 將待測(cè)的T-DNA插入突變體和野生菌FGH2分別接種于PDA培養(yǎng)基平板上，暗培養(yǎng)10 d后，用直徑0.7 cm的打孔器在菌落的邊緣處選取菌餅，置于PDA平板中心，每皿1塊，暗培養(yǎng)15 d后對(duì)其進(jìn)行菌落形態(tài)的觀察和分類。

根據(jù)突變體的菌落形態(tài)和黑色微菌核的有無(wú)將其分為菌核型、菌絲型和中間型3種類型［14］。分類標(biāo)準(zhǔn)如下:菌落表面為白色氣生菌絲團(tuán)、基質(zhì)內(nèi)布滿黑色微菌核的為菌核型;菌落上氣生菌絲少、產(chǎn)生少量黑色微菌核的為中間型;菌落上氣生菌絲發(fā)達(dá)、白色、絨毛狀，培養(yǎng)15 d后仍未產(chǎn)生黑色微菌核的為菌絲型。

1.2.3 大麗輪枝菌T-DNA插入突變體的致病力測(cè)定 大麗輪枝菌T-DNA插入突變體的致病力測(cè)定采用分生孢子浸根移栽法［11］。將供試的銀山1號(hào)棉種脫絨催芽，在溫室中進(jìn)行育苗。收集待測(cè)的大麗輪枝菌T-DNA插入突變體和大麗輪枝菌FGH2分生孢子懸浮液，調(diào)節(jié)其體積分?jǐn)?shù)為1.0×107個(gè)·mL－1。待棉苗長(zhǎng)至 2片真葉時(shí)，挑選根系生長(zhǎng)良好的植株進(jìn)行浸根接種后，移栽至裝有無(wú)菌土的紙杯中，25℃下生長(zhǎng)。每個(gè)菌株接種15棵棉苗，3次重復(fù)。30 d左右時(shí)接種30 d后，按照石磊巖等棉花苗期分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情調(diào)查［15］。

1.2.4 大麗輪枝菌微菌核形成缺陷的T-DNA插入突變體側(cè)端序列擴(kuò)增 挑選大麗輪枝菌T-DNA插入菌絲型突變體和大麗輪枝菌FGH2于Czapek液體培養(yǎng)基中，150 r·min－1培養(yǎng) 6 d，收集菌絲用于DNA提取。采用CTAB法提取菌株的基因組DNA。采用TAIL-PCR法擴(kuò)增突變體T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)端序列，試驗(yàn)參照 LIU等［16］的方法進(jìn)行。所用隨機(jī)引物序列和特異性引物序列見(jiàn)表1。將初始PCR產(chǎn)物稀釋20倍作為第2輪PCR的模板，第2輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為第3輪PCR的模板。

表1 hiTAIL-PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers list used for hiTAIL-PCR

1.2.5 PCR產(chǎn)物連接、測(cè)序和序列分析 將第3輪PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。獲得的突變體T-DNA插入位點(diǎn)右側(cè)序列與美國(guó) BROAD 研 究 網(wǎng) 址 (http://www.broad.mit.edu/)公布的大麗輪枝菌VDLs.17和黑白輪枝菌(V.albo-atrum)VaMs.102的基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大麗輪枝菌的遺傳轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)構(gòu)建大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫(kù)。將誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌菌液與大麗輪枝菌分生孢子懸浮液涂在濾膜上共培養(yǎng)48 h，將濾膜置于含50 mg·L－1潮霉素抗性的PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)上。將選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子再轉(zhuǎn)接到含70 mg·L－1潮霉素PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行2次篩選。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行單孢分離和保存，共獲得了270個(gè)大麗輪枝菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化子。

2.2 大麗輪枝菌微菌核形成能力喪失或減弱的T-DNA插入突變體的篩選

將獲得的270個(gè)T-DNA插入突變體和野生型大麗輪枝菌FGH2活化后，接于PDA培養(yǎng)基中，25℃下生長(zhǎng)15 d，測(cè)量菌落直徑并觀察微菌核形成情況。野生型大麗輪枝菌FGH2在PDA培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生大量微菌核，氣生菌絲較為發(fā)達(dá)。突變體11-2、26-2、229-2-1、971-1 均為菌絲型，菌落氣生菌絲濃密，且不產(chǎn)生微菌核(圖1)。

圖1 野生型FGH2和突變體在PDA平板上培養(yǎng)15d后菌落形態(tài)(正、反面)Fig.1 The colony morphology of FGH2and mutants grown on PDA plate for 15 days(the front and the back)

2.3 大麗輪枝菌T-DNA插入突變體的致病力測(cè)定

對(duì)270個(gè)大麗輪枝菌T-DNA插入突變體和野生型菌株進(jìn)行孢子懸浮液浸根接種，測(cè)定突變體與野生型的致病性差異。結(jié)果表明，大麗輪枝菌FGH2接種感病品種銀山1號(hào)14 d左右葉片開(kāi)始發(fā)病，30 d左右棉苗表現(xiàn)為落葉、死亡，維管束變褐，病情指數(shù)達(dá)95.21。大多數(shù)大麗輪枝菌T-DNA插入突變體的致病力與野生型無(wú)顯著性差異(圖2)。

圖2 大麗輪枝菌突變體接種棉花銀山1號(hào)30 d后發(fā)病情況Fig.2 Pathogenicity assays of V.dahliae FGH2 and four microsclerotia defective mutants on cotton Yinshan 1 post inoculation 30 days

2.4 大麗輪枝菌微菌核形成能力喪失T-DNA插入突變體側(cè)端序列分析

采用高效TAIL-PCR方法對(duì)大麗輪枝菌4個(gè)菌絲型T-DNA插入突變體的插入位點(diǎn)側(cè)端序列進(jìn)行擴(kuò)增，將第二輪和第三輪的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳圖譜分析，對(duì)第二、三輪的條帶大小做比較，理論上第三輪的條帶比第二輪小約70 bp，為本研究所需要的特異性條帶，將這4個(gè)突變體的第三輪全部產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，進(jìn)行切膠回收，得到突變體 11-2(A)、26-2(B)、229-2-1(C)和 971-1(D)含量較高的4條特異性條帶(圖3)，獲得目標(biāo)片段片段大小分別約為 600、350、300、500 bp。

圖3 大麗輪枝菌突變體T-DNA側(cè)翼序列hiTAILPCR第二步和第三步產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns of V.dahliae mutants T-DNA flanking sequence secondary and tertiary hiTAIL-PCR products.

對(duì)目標(biāo)片段回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌克隆，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送生物公司進(jìn)行DNA測(cè)序。將獲得的大麗輪枝菌突變體T-DNA側(cè)端序列與已在網(wǎng)上公布的大麗輪枝菌VDLs.17和黑白輪枝菌VaMs.102進(jìn)行比對(duì)，獲得突變體T-DNA在大麗輪枝菌基因組插入位點(diǎn)的信息(表2)。突變體229-2-1 T-DNA插入位點(diǎn)位于基因VDAG_08333.1編碼區(qū)，突變體11-2T-DNA插入位點(diǎn)位于基因VDAG_07013.1啟動(dòng)子區(qū)969 bp，26-2 T-DNA插入位點(diǎn)位于基因VDAG_02793.1啟動(dòng)子區(qū)716 bp，而突變體971-1 T-DNA插入位點(diǎn)位于 2個(gè)基因 VDAG_05438.1和 VDAG_05439.1 之間。

表2 T-DNA側(cè)翼序列與 VdLs.17基因組序列比對(duì)結(jié)果Table 2 BLAST results of T-DNAflanking sequences hit to VdLs.17 genome

3 結(jié)論與討論

隨著多種植物病原真菌全基因序列的完成，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建覆蓋全基因組的T-DNA插入突變體庫(kù)，從全基因組水平研究植物病原真菌重要功能基因，進(jìn)而鑒定關(guān)鍵的致病基因，已成為重要研究方向和研究方法［17－20］。本研究利用ATMT技術(shù)構(gòu)建大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫(kù)，獲得了270個(gè)突變體，通過(guò)菌落形態(tài)觀察，篩選出4個(gè)菌絲型突變體，氣生菌絲發(fā)達(dá)、白色絨毛狀，在長(zhǎng)期培養(yǎng)和多代轉(zhuǎn)接后，仍不產(chǎn)生黑色微菌核，并得到了其側(cè)端序列。其中突變體229-2-1 T-DNA插入位點(diǎn)位于基因VDAG_08333.1編碼區(qū)，突變體11-2，26-2 T-DNA插入位點(diǎn)分別位于基因VDAG_07013.1和VDAG_02793.1的啟動(dòng)子區(qū)，而突變體971-1 T-DNA插入位點(diǎn)位于VDAG_05438.1和VDAG_05439.1 2個(gè)基因之間。推測(cè)這4個(gè)菌絲型突變體的表型變異可能由于T-DNA插入突變引起，為進(jìn)一步研究這些微菌核形成相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。

大麗輪枝菌產(chǎn)生由黑色素和菌絲細(xì)胞構(gòu)成的微菌核，在遇到不利環(huán)境時(shí)黑色素顆粒可使微菌核進(jìn)入休眠狀態(tài)，以抵抗不同的環(huán)境壓力條件，有利于微菌核的長(zhǎng)期存活。已有研究表明，黑色素為稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)致病所必需的，稻瘟病菌黑色素形成喪失的突變體不能形成有功能的附著胞，從而喪失對(duì)水稻的致病性［21］。目前尚無(wú)研究表明，黑色素與大麗輪枝菌微菌核的形成與致病性的關(guān)系。本研究獲得的4個(gè)大麗輪枝菌菌絲型突變體，黑色素形成喪失且不產(chǎn)生微菌核，但這4個(gè)菌絲型突變體的致病力與大麗輪枝菌FGH2并無(wú)顯著性差異。由于本研究獲得返微菌核缺失突變體偏少，有必要進(jìn)一步利用已建立的突變體庫(kù)，大量篩選微菌核形成能力減弱和喪失的突變體，在獲得其側(cè)端序列后，采用目標(biāo)基因敲除和互補(bǔ)等手段，大規(guī)模鑒定微菌核形成相關(guān)基因。在此基礎(chǔ)上，深入研究大麗輪枝菌微菌核形成的分子機(jī)理，探討菌微菌核形成、黑色素與致病性的關(guān)系等。

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