舒發(fā)明，劉業(yè)方，黃 英，馮全生，鄭秀麗

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

濕溫病“內(nèi)外相引”的機(jī)理研究?

舒發(fā)明，劉業(yè)方，黃 英，馮全生，鄭秀麗△

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

目的:觀察外濕(濕邪)對正常大鼠和脾虛造模大鼠胃腸功能影響的規(guī)律及其機(jī)制，從分子生物學(xué)角度揭示濕邪作用機(jī)體產(chǎn)生損傷的機(jī)理，探討濕溫病“內(nèi)外相引”的機(jī)理。方法:將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白對照組、外濕組、內(nèi)濕組、內(nèi)外兼濕組4組各10只。采用ELISA法檢測各組大鼠胃竇生長抑素(SS)、P物質(zhì)(SP)、血清中胃動(dòng)素(MTL)及胃泌素(GAS)的變化，HE染色觀察胃腸組織病理改變。結(jié)果:外濕組、內(nèi)濕組大鼠胃竇SS、SP、MTL及GAS含量均較空白對照組降低，內(nèi)外兼濕組顯著降低。病理結(jié)果顯示，外濕組、內(nèi)濕組、內(nèi)外兼濕組胃組織均存有不同程度的充血、炎癥、糜爛，小腸組織亦發(fā)現(xiàn)充血、炎癥，內(nèi)外兼濕組可見輕度糜爛，且小腸組織病理形態(tài)改變較胃組織輕。結(jié)論:外濕組、內(nèi)濕組、內(nèi)外兼濕組均存在大鼠胃腸激素、胃腸病理組織改變，表明濕與脾胃關(guān)系密切，而內(nèi)外兼濕組改變最明顯，客觀表明“內(nèi)外相引”為濕溫病的重要病機(jī)。

濕溫;內(nèi)外相引;生長抑素(SS);胃竇P物質(zhì)(SP);胃動(dòng)素(MTL);胃泌素(GAS)

溫病學(xué)認(rèn)為，濕溫病的發(fā)病是由于外濕引動(dòng)內(nèi)濕而成，外邪入里，里濕為合，內(nèi)因脾胃不能運(yùn)化水谷之濕，外因感受時(shí)令之濕導(dǎo)致“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”。因此，本課題擬以外濕對脾虛大鼠胃腸功能的影響為切入點(diǎn)進(jìn)行濕溫病“內(nèi)外相引”的機(jī)制研究，觀察外濕(濕邪)對正常大鼠和脾虛造模大鼠胃腸功能影響的規(guī)律及其機(jī)制，從分子生物學(xué)角度揭示濕邪作用機(jī)體產(chǎn)生損傷的機(jī)理，探討濕溫病“內(nèi)外相引”的機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康 SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號scxk-09-2006)。

1.2 主要試劑與儀器

SP、SS、MTL、GAS放免試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，電子秤(ACS-3H，中山市金利電子衡器有限公司制造)、AvantiTM30型冷凍離心機(jī)(BECKMAN)、光學(xué)顯微鏡(Olympus BX43日本)和Mias2001圖像分析系統(tǒng)等。

2 方法

2.1 分組

將40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、外濕組、內(nèi)濕組、內(nèi)外兼濕組4組，每組各10只。

2.2 造模

參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行［1］。外濕組每天定時(shí)放入水深25 cm、水溫27℃～29℃的水桶中游泳15 min。平時(shí)使用加濕器霧化加濕持續(xù)7 d，復(fù)制外濕模型。內(nèi)濕組按25 ml/kg劑量在第1、3、5、7天行液態(tài)豬油灌胃，第2、4、6天行30%蜂蜜灌胃持續(xù)7 d，復(fù)制脾虛內(nèi)濕模型。內(nèi)外兼濕組每天定時(shí)放入水深25 cm、水溫27℃ ～29℃的水桶中游泳15 min，游泳完畢后，立即按25 ml/kg劑量在第1、3、5、7天行液態(tài)豬油灌胃，第2、4、6天行30%蜂蜜灌胃持續(xù)7 d，復(fù)制脾虛兼外濕模型?？瞻讓φ战M不采取任何措施。

2.3 觀測指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 一般情況觀察 每日觀察精神、活動(dòng)、二便、體質(zhì)量等，定時(shí)記錄飲食量。

2.3.2 胃和小腸組織病理形態(tài)觀察 造模后第8天處死動(dòng)物，取胃和小腸置10%甲醛水溶液中固定，各級濃度脫水、常規(guī)石蠟切片、HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。

2.3.3 血清MTL、GAS水平測定 ELISA法檢測血清胃動(dòng)素(MTL)和胃泌素(GAS)水平。大鼠腹腔麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，3000 r/min離心10 min，分離血清保存在-20℃ 冰箱中，具體檢測按MTL、GAS酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3.4 胃竇SS、SP水平測定 胃竇組織勻漿后，ELISA法檢測胃竇P物質(zhì)(SP)和生長抑素(SS)水平。剪取適量胃竇組織稱重，按胃竇組織體積與生理鹽水體積比1∶5比例，盡快加入生理鹽水于勻漿器中碾磨制成勻漿，4℃ 3000 r/min離心15 min，取上清-20℃ 保存?zhèn)錅y，具體檢測方法按SP、SS酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異性檢驗(yàn)滿足正態(tài)性分布采用方差分析，組間兩兩比較方差齊用LSD法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 模型一般體征的觀察結(jié)果

造模后，外濕組、內(nèi)濕組和內(nèi)外兼濕組大鼠均出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少、精神較差、食欲不振、飲食量減少、大便溏、皮毛色澤晦暗發(fā)黃、消瘦、腹脹、體質(zhì)量減輕等癥狀，脾虛兼外濕組變化最為明顯。

3.2 SS、SP、MTL、GAS含量測定結(jié)果

表1顯示，與空白對照組比較，外濕組大鼠的SS、SP、MTL、GAS含量均有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，內(nèi)濕組大鼠的SS、SP、MTL、GAS含量顯著降低(P＜0.05)，內(nèi)外兼濕組以上指標(biāo)含量降低極為顯著(P＜0.01)。與外濕組比較，內(nèi)濕組大鼠的SS、SP、MTL、GAS含量均顯著降低(P＜0.05)，內(nèi)外兼濕組以上指標(biāo)降低極顯著(P＜0.01)。與內(nèi)濕組比較，內(nèi)外兼濕組大鼠的SS、SP、MTL、GAS降低更為顯著(P＜0.05)。

表1 各組大鼠SS、SP、MTL、GAS比較(ng/mL，±s)

表1 各組大鼠SS、SP、MTL、GAS比較(ng/mL，±s)

注:與空白對照組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與外濕組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與內(nèi)濕組比較:▲P＜0.05

組別 鼠數(shù)GAS SS SP MTL空 白 對 照 組10 0.31±0.23 0.43±0.520 0.39±0.44 0.61±0.21外 濕 組 10 0.25±0.52 0.22±0.080 0.22±0.06 0.43±0.15內(nèi) 濕 組 10 0.14±0.04△＊ 0.17±0.054△＊ 0.13±0.03△＊ 0.39±0.18△＊內(nèi) 外 兼 濕 組 10 0.08±0.30△△＊＊▲ 0.08±0.290△△＊＊▲ 0.09±0.03△△＊＊▲ 0.25±0.17△△＊＊▲

3.3 胃腸組織病理觀察

圖1、2顯示，對外濕、內(nèi)濕和內(nèi)外兼濕3種模型組大鼠解剖發(fā)現(xiàn)，多數(shù)動(dòng)物胃腸脹氣明顯，胃內(nèi)殘留食糜較多。HE染色后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，空白對照組胃腸組織均無明顯改變，外濕、內(nèi)濕和內(nèi)外兼濕3種模型組動(dòng)物胃組織黏膜有不同程度黏膜充血、炎癥細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)浸潤、黏膜灶性糜爛，部分腺體排列欠規(guī)則，黏膜腺體破壞，一些細(xì)胞呈散在分布處于增生狀態(tài)(漿多、核大、染色質(zhì)稀疏)，可見點(diǎn)狀、條索狀纖維增生，以上胃組織病理變化嚴(yán)重程度按外濕組、脾虛組、內(nèi)外兼濕組的次序而遞增;小腸組織病理形態(tài)與胃組織相似，但其充血、炎癥程度較胃組織輕，且只有內(nèi)外兼濕組出現(xiàn)有輕度糜爛，外濕、內(nèi)濕組均未見糜爛。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，脾主運(yùn)化水濕為陰土，喜燥惡濕，對濕邪有特殊的易感性，所以脾具有運(yùn)濕而惡濕的特性。濕為長夏主氣，脾為濕土之臟，濕為土之氣，同氣相從，故濕與脾土相應(yīng)易阻滯氣機(jī)、困阻脾胃，導(dǎo)致脾失健運(yùn)，出現(xiàn)胃腸消化功能的受損。溫病學(xué)家薛生白《濕熱病》指出，濕溫病的發(fā)病為“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”，即外濕引動(dòng)內(nèi)濕，以內(nèi)濕為基礎(chǔ)。

中醫(yī)脾胃主運(yùn)化的功能包含現(xiàn)代醫(yī)學(xué)胃腸消化吸收的生理過程，消化道的運(yùn)動(dòng)除受神經(jīng)調(diào)節(jié)外，還受胃腸激素的調(diào)節(jié)。胃腸激素是一類由胃腸道黏膜層及胰腺內(nèi)的內(nèi)分細(xì)胞和旁分泌細(xì)胞分泌、由胃腸壁的神經(jīng)末梢所釋放的一組小分子高效能生物活性物質(zhì)［2］，在胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。胃腸激素當(dāng)中P物質(zhì)是主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其能直接作用于環(huán)形肌、縱行肌引起收縮，進(jìn)而促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)?，F(xiàn)代研究表明，P物質(zhì)調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)可能是通過其參與消化間期移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)來實(shí)現(xiàn)的［3］。生長抑素有多種分子形式，它幾乎對所有的生理性內(nèi)外分泌反應(yīng)均有抑制作用［4］，可抑制胃泌素、腸的蠕動(dòng)等各種胃腸激素的分泌等，故對胃腸黏膜的損傷具有保護(hù)作用［5］。胃動(dòng)素(MTL)則具有強(qiáng)烈刺激上消化道的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和生理性肌電活動(dòng)的作用，是啟動(dòng)移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)Ⅲ相的重要啟動(dòng)因子之一［6］，它的主要生理功能為刺激胃和腸的運(yùn)動(dòng)及促進(jìn)胃蛋白酶分泌，參與消化道運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。胃泌素(GAS)則具有刺激胃蛋白酶、胃酸的分泌，使幽門括約肌和胃竇收縮、幫助消化、延緩胃排空等作用［7］。

本實(shí)驗(yàn)中，外濕組、內(nèi)濕組、內(nèi)外兼濕組大鼠胃腸激素、胃腸病理組織均改變，表明濕邪易傷脾胃，濕邪與脾胃關(guān)系密切，外濕組、內(nèi)濕組、內(nèi)外兼濕組大鼠胃竇的SP含量降低，導(dǎo)致其不能發(fā)揮對胃腸道的興奮性刺激作用，外濕組、內(nèi)濕組、內(nèi)外兼濕組大鼠可能存在胃腸動(dòng)力不足，這與濕邪困脾所表現(xiàn)的胃脘痞滿、納差嘔吐、大便稀溏等臨床癥狀一致。同時(shí)外濕組、內(nèi)濕組、內(nèi)外兼濕組3種模型組SS的含量也降低，這表明SS對消化系統(tǒng)的抑制作用減弱，其對胃酸、胃蛋白酶等分泌抑制作用解除、胃腸道的保護(hù)屏障可能受到破壞。本實(shí)驗(yàn)中外濕組、內(nèi)濕組、內(nèi)外兼濕組3種模型組MTL、GAS降低，這可能是濕邪釋放各種免疫因子使迷走神經(jīng)興奮和抑制失調(diào)，使MTL和GAS分泌異常。也或因濕邪導(dǎo)致炎癥、缺血使胃腸道瘀血、胃腸黏膜細(xì)胞分泌MTL失常，而胃擴(kuò)張減緩、胃竇部壓力減輕，可使GAS釋放減少。在與空白對照組比較中，脾虛和脾虛兼外濕組變化更為明顯，表明濕邪涉及到臟器病變，進(jìn)而使MTL及GAS代謝水平異常。脾虛兼外濕組SP、SS、MTL以及GAS的含量較外濕組和內(nèi)濕組降低更為明顯，亦說明內(nèi)外兼濕胃動(dòng)力受抑制程度、胃腸道保護(hù)屏障的破壞程度更嚴(yán)重，從客觀上體現(xiàn)了葉天士提出的“外邪入里，里濕為合”、外濕引動(dòng)內(nèi)濕的理論，也與薛生白提到的“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引”的原理相符，為濕溫病“內(nèi)外相引”的發(fā)病特點(diǎn)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但濕溫病“內(nèi)外相引”的相關(guān)調(diào)控通路尚待進(jìn)一步的深入研究。

圖1 各組大鼠胃組織切片HE染色結(jié)果(HE×200)

圖2 各組大鼠小腸組織切片HE染色結(jié)果(HE×200)

［1］陳佩嬋，文小敏，譚永振，等.三仁湯對脾胃濕熱證、濕偏重證大鼠胃竇P物質(zhì)、生長抑素的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28(2):22-24.

［2］姚泰，吳博威.生理學(xué)［M］.6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005.

［3］趙平，董雷，蘭康，等.多種胃腸激素在消化間期移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)中作用的研究［J］.中華消化雜志，2005，25(2):95-97.

［4］趙洪禮，吳戰(zhàn)軍，謝艷娜.生長抑素臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.齊魯藥事，2009，28(7):416-419.

［5］Abd uF，HicksGA，HhennigG，AllenJP，GrundyD. Somatostatinsst(2)receptors inhibit perstalsis in the rat and mouse jejunum［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2002，282(4):624-633.

［6］Carlini VP，Ghersi M，Schith HB，et al.Ghrelin and memory: differential effects on acquisition and retrieval［J］.Peptides，2010，31(6):1190-1193.

［7］Dockray G，Dimaline R，Varro A.Gastrin:old hormone，new functions［J］.Pflugers Arch，2005，449(4):344-355.

Mechanism research of Dampness warm diseases"internal and external leading"

SHU Fa-ming，LIU Ye-fang，HUANG-Ying，F(xiàn)ENG Quan-Sheng，ZHENG Xiu-li△
(Chengdu University of Chinese Medicine，Sichuan Chengdu 610075，China)

Objective:To observe the influence of dampness pathogen on gastrointestinal function of normal rats and spleen deficiency rats and investigate the changing rule of gastrointestinal hormones，to approach the mechanism of damage of body from molecular perspective and to investigate internally and externally interattraction.Methods:A total of 40 rats were divided into 4 groups(each group 10 rats)randomly:the normal control group、the internal wet group、the external wet group、the internal and external wet group.The contents of SS、SP、MTT and GAS in sinus ventriculi were detected by radioimmunoassay，gastrointestinal pathologic changes were observed by HE staining.Results:The contents of SS、SP、MTT and GAS in the internal wet group、the external wet group、the internal and external wet group were obviously lower than those in the normal control group，with the contents of SS、SP、MTT and GAS in internal and external wet group decreased more.Pathology showed:Gastric tissue models(in the internal wet group、the external wet group、the internal and external wet group)have different levels of congestion、inflammation、erosion，intestinal tissues of model group also found that congestion，inflammation，internal and external interattraction showed mild erosion，and the pathological changes of the latter is lighter than the former.Conclusions:There is the certain disorder of gastrointestinal hormones in sinus ventriculi of rats with internal，external wet and Internal and external wet syndromes，pathological changes were generated from stomach and testine tissue.Wet is related to spleen and stomach.Internal and external interattraction is the important pathogenesis of damp warm diseases.

Damp-warm disease;Internally and externally interattraction;SS;SP;Motilin;Gastrin

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1377-03

2015-04-24

成都中醫(yī)藥大學(xué)校基金項(xiàng)目-濕溫“內(nèi)外相引”的機(jī)理研究(ZRYB201023)

舒發(fā)明(1988-)，男(瑤族)，廣西桂林人，醫(yī)學(xué)碩士，從事溫病學(xué)的臨床與研究。

△通訊作者:鄭秀麗，女，講師，從事溫病學(xué)的臨床與研究，Tel:13880937093，E-mail:43726134@qq.com。