劉厚淶，王克林，孫 剛，王笑紅，翟志光，范紅江

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

流感藥效實(shí)驗(yàn)中體質(zhì)量變化差值預(yù)測作用研究?

劉厚淶，王克林△，孫 剛，王笑紅，翟志光，范紅江

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

目的:揭示體質(zhì)量變化差值在流感藥效實(shí)驗(yàn)中的預(yù)測作用。方法:采用甲型流感病毒感染小鼠模型，達(dá)菲作為陽性藥物，每天固定時(shí)間稱量體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量變化差值并進(jìn)行藥效預(yù)測;實(shí)驗(yàn)第5天解剖小鼠取肺組織稱量后計(jì)算肺指數(shù)并確定藥效;比較體質(zhì)量變化差值藥效預(yù)測結(jié)果與肺指數(shù)藥效評(píng)價(jià)結(jié)果，最后判斷體質(zhì)量變化差值預(yù)測藥效的可行性。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)第4天體質(zhì)量變化差值的藥效預(yù)測結(jié)果和肺指數(shù)藥效評(píng)價(jià)結(jié)果一致。結(jié)論:第4天的體質(zhì)量變化差值可以用于預(yù)測小鼠流感實(shí)驗(yàn)的藥效。

甲型流感病毒;體質(zhì)量變化差值;肺指數(shù);藥效預(yù)測

在流感動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，一般采用肺指數(shù)來判斷小鼠肺損傷的程度以及評(píng)價(jià)藥物療效［1-2］。本文探討體質(zhì)量變化差值、體質(zhì)量與肺指數(shù)在流感實(shí)驗(yàn)藥效評(píng)價(jià)中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

BALB/c小白鼠，體質(zhì)量(16±2)g，雌雄各半，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(京)2010-0032)。飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)企業(yè)審查合格證號(hào)京飼審(2009)06166)。

1.2 藥物

達(dá)菲膠囊由瑞士Roche公司生產(chǎn)，上海分公司分裝(批號(hào)B1162)。

1.3 流感病毒

甲型流感病毒小鼠肺適應(yīng)株［A/FM/1/47 (H1N1)］從中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院(現(xiàn)國家CDC病毒所)引進(jìn)。雞胚傳代培養(yǎng)，收集雞胚尿囊液，于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 儀器

天平 (奧 豪 斯“Adventurer”系 列，型 號(hào)AR153CN)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 小鼠分組 將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、染毒組、達(dá)菲組3組各10只，雌雄各半。

1.5.2 小鼠染毒 實(shí)驗(yàn)第1天以35個(gè)LD50(半數(shù)致死量)的流感病毒給染毒組和達(dá)菲組小鼠滴鼻感染，每只小鼠35 ul。流感病毒傳代及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在相應(yīng)級(jí)別的生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。達(dá)菲組小鼠按27.5 mg/kg體質(zhì)量，每天下午1∶00灌胃給予達(dá)菲1次，其他組小鼠給予相同體積的生理鹽水。

1.5.3 稱量體質(zhì)量、肺重并計(jì)算肺指數(shù) 實(shí)驗(yàn)周期為5 d，每天下午1∶00稱量各組小鼠體質(zhì)量。第5天解剖小鼠取肺組織，用濾紙吸干表面血液后稱重并計(jì)算肺指數(shù):肺指數(shù)(%)=肺重(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)及其體質(zhì)量變化特征

2.1.1 一般狀態(tài) 正常組小鼠精神狀態(tài)好、活躍，毛發(fā)有光澤，抓力大，飲食正常;染毒組精神狀態(tài)差、不活躍、易蜷縮，毛發(fā)灰暗無光澤，抓力小，飲食減少;達(dá)菲組毛發(fā)稍暗，其他方面與正常組無明顯區(qū)別。

2.1.2 體質(zhì)量值變化特征 各組小鼠體質(zhì)量值都符合正態(tài)分布且方差齊性，因此采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖1顯示，正常組小鼠體質(zhì)量值從第1天到第5天逐漸增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，5 d共增加1.38 g(+7.6%)。

圖1 流感小鼠組內(nèi)體質(zhì)量隨感染時(shí)間變化趨勢(±s)

圖1顯示，染毒組小鼠體質(zhì)量值第1天至第2天有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);第3天至第5天一直下降，與第1天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);同時(shí)第3天至第5天與各自前1 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，5 d共下降3.44g(-19.2%)。達(dá)菲組小鼠體質(zhì)量值與第1天比較，第2天、第3天變化不明顯(P＞0.05);第4天至第5天明顯下降(P＜0.05)，與各自前1 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)，5 d共下降0.96 g(-5.3%)。

圖2顯示，與正常組比較，第3天至第5天染毒組、達(dá)菲組小鼠體質(zhì)量值均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與染毒組比較，第3天達(dá)菲組小鼠體質(zhì)量值略高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，第4天至第5天達(dá)菲組小鼠體質(zhì)量值較高，第4天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，第5天差異更顯著(P＜0.01)。

2.2 小鼠體質(zhì)量變化差值的變化特征

體質(zhì)量變化差值為當(dāng)天體質(zhì)量與染毒前1 d體質(zhì)量之差值。各組小鼠體質(zhì)量變化差值符合正態(tài)分布且方差齊性，故采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖1顯示，各組小鼠體質(zhì)量變化差值的變化特征與體質(zhì)量值變化特征類似。圖2顯示，與上述體質(zhì)量值變化不同，第2天開始與正常組比較，染毒組小鼠體質(zhì)量變化差值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，達(dá)菲組小鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與染毒組比較，達(dá)菲組小鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。第3天至第5天與上述體質(zhì)量變化類似，與正常組比較，染毒組、達(dá)菲組小鼠體質(zhì)量變化差值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明體質(zhì)量變化差值比體質(zhì)量更靈敏且能更早反映流感病毒致病性。其中，與上述體質(zhì)量變化不同，第3天達(dá)菲組小鼠體質(zhì)量變化差值高于染毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);第4天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，再次證明體質(zhì)量變化差值是比體質(zhì)量更靈敏的指標(biāo)。

圖2 流感小鼠組間體質(zhì)量隨感染時(shí)間變化特征(±s)

圖3 流感小鼠組間體質(zhì)量變化差值隨感染時(shí)間變化特征(±s)

2.3 小鼠肺組織形態(tài)及肺指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 肺組織形態(tài) 正常組小鼠肺組織顏色呈粉白色、無充血;染毒組小鼠肺組織顏色呈血紅色、有充血;達(dá)菲組小鼠肺組織顏色呈粉白色、無充血，表明達(dá)菲減輕了流感病毒導(dǎo)致的肺損傷。

2.3.2 肺指數(shù)比較 各組小鼠肺指數(shù)都符合正態(tài)分布且方差齊性，因此采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖4顯示，與正常組比較，染毒組、達(dá)菲組小鼠肺指數(shù)較大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與染毒組比較，達(dá)菲組小鼠肺指數(shù)較低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明達(dá)菲既有減輕流感小鼠肺損傷并有減少流感小鼠體質(zhì)量下降作用。因此，進(jìn)一步證實(shí)肺指數(shù)是流感小鼠藥效實(shí)驗(yàn)的客觀指標(biāo)［1-2］。

2.4 體質(zhì)量變化差值與體質(zhì)量值用于預(yù)測流感小鼠藥效實(shí)驗(yàn)的比較分析

圖4 流感小鼠肺指數(shù)比較(±s)注:與正常組比較:★★P＜0.01;與染毒組比較:▇▇P＜0.01

達(dá)菲組與染毒組差異性比較，第3天體質(zhì)量變化差值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，體質(zhì)量值為P＞0.05，而肺指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。第4天體質(zhì)量變化差值和肺指數(shù)的P值一致(P＜0.01)，體質(zhì)量值為P＜0.05，而肺指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明體質(zhì)量變化差值比體質(zhì)量值更為靈敏。

表1～表3顯示，3次實(shí)驗(yàn)和本項(xiàng)目組以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體質(zhì)量變化差值第4天的結(jié)果與實(shí)際藥效評(píng)價(jià)結(jié)果相符程度更好，因此第4天的體質(zhì)量變化差值可以預(yù)測小鼠流感實(shí)驗(yàn)藥效結(jié)果。也就是說，第4天的體質(zhì)量變化差值可以作為預(yù)測小鼠流感藥效實(shí)驗(yàn)的參考指標(biāo)。

表1 流感實(shí)驗(yàn)第3天各變量間比較(P)

表2 流感實(shí)驗(yàn)第4天各變量間比較(P)

表3 流感實(shí)驗(yàn)第5天各變量間P值

3 討論

采用體質(zhì)量變化差值預(yù)測指標(biāo)，不用解剖小鼠(觀察對(duì)象)就可以評(píng)價(jià)藥效，符合中醫(yī)“望、聞、問、切”的診斷特征，對(duì)開展中醫(yī)藥動(dòng)物模型研究有重要意義。

流感藥效實(shí)驗(yàn)一般至少分為正常組、染毒組、陽性藥物組、實(shí)驗(yàn)藥物組，其中實(shí)驗(yàn)藥物組進(jìn)一步分為大劑量、中劑量、小劑量3組共6組。每組往往需要收集血、肺、脾、肝、腎、肌肉(6種樣品)以此計(jì)算，共要收集360個(gè)樣品。采用本研究的體質(zhì)量變化差值可以在取材前預(yù)測藥效，減少變化不明顯實(shí)驗(yàn)組的數(shù)量，減少2組來計(jì)算至少減少120個(gè)樣品的收集，可以節(jié)約大量人力、物力。小鼠感染流感病毒后體質(zhì)量下降的原因，可能是感染流感病毒后小鼠飲食減少導(dǎo)致體質(zhì)量下降，也可能與流感病毒在小鼠體內(nèi)大量復(fù)制，抑制蛋白質(zhì)等物質(zhì)正常合成有關(guān)，確切機(jī)制有待進(jìn)一步的研究闡明。本實(shí)驗(yàn)采用體質(zhì)量為(16±2)g的BALB/c小鼠，流感病毒感染率較高，這種小鼠生長速度適中，受節(jié)氣等外界因素影響較小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

總之，體質(zhì)量差值與肺指數(shù)用于評(píng)價(jià)流感小鼠實(shí)驗(yàn)藥效結(jié)果相符，特別是第4天的體質(zhì)量變化差值預(yù)測流感藥效的準(zhǔn)確率較高，因此體質(zhì)量變化差值可以用于流感實(shí)驗(yàn)藥效的預(yù)測。

［1］翟志光，王克林，孫剛，等.板藍(lán)根顆粒和苦甘顆粒對(duì)流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，11:987-989.

［2］趙鐵華，鄧淑華，楊鶴松，等.半枝蓮總黃酮抗甲型H1N1流感病毒感染的藥效學(xué)研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，30 (1):147-148.

Study on the prediction of the difference of body weight in the influenza drug effect experiment

LIU Hou-lai，WANG Ke-lin△，SUN Gang，WANG Xiao-hong，ZHAI Zhi-guang，F(xiàn)AN Hong-jiang
(Institute of Basic Theories，China Academy of Chinese Medicine Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:To reveal prediction of change value of body weight in effect of drugs against influenza. Methods:After infected with influenza A virus，A/FM/1/47(H1N1)，mice were weighed and taken Tamiflu everyday.On fifth day mice anatomized，lung tissue were taken out and weighed.Change value of Body weight and lung index was calculated then.The possibility of prediction of change value of body weight was analyzed in effect of drugs against influenza finally.Results:On fourth day，change value of body weight is consistent with the lung index in evaluation of drugs effect.Conclusion:Change value of body weight can be used to predict effect of drugs against influenza on fourth day.

Influenza A virus;Change value of body weight;Lung index;Prediction of drugs effect

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1380-02

2015-01-14

國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10004301-008);中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題(YZ-1314，YZ-1413)

劉厚淶(1989-)，男，江西人，在讀碩士，從事中醫(yī)藥防治流感的相關(guān)研究。

△通訊作者:王克林(1964-)，男，河北人，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥防治病毒性疾病的分子機(jī)制研究，Tel: 010-64089021。