王俊巖，張 林，何信用，陳文娜，孔令東，賈 博

(遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847)

補腎健脾方藥對尾部懸吊大鼠骨組織形態(tài)學影響的研究?

王俊巖，張 林△，何信用，陳文娜，孔令東，賈 博

(遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847)

目的:觀察補腎、健脾和補腎健脾三方對尾部懸吊大鼠骨形態(tài)計量學的影響。方法:將大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、懸吊組、補腎組、健脾組和補腎健脾組5組。除正常組外，其余各組大鼠采用頭低位-30°尾部懸吊法模擬失重，連續(xù)懸吊21 d。補腎組、健脾組、補腎健脾組每天給予對應方藥灌胃，其余各組給予等體積生理鹽水灌胃。實驗21 d后，ELISA法檢測血清骨鈣素含量、雙能X射線骨密度分析儀檢測骨密度、股骨硝酸銀染色、脛骨HE染色觀察骨組織形態(tài)。結(jié)果:與正常組比較，懸吊組血清骨鈣素、股骨骨密度、股骨骨小梁面積百分率、厚度、數(shù)量均明顯降低，骨小梁分離度顯著增高，脛骨骨小梁明顯稀疏;與懸吊組比較，補腎組、健脾組和補腎健脾組各項指標明顯改善，且以補腎健脾組改善較為明顯。結(jié)論:補腎、健脾和補腎健脾三方均對模擬失重引起的骨丟失具有防護作用，能有效改善骨形態(tài)計量學參數(shù)，以補腎健脾方藥作用為優(yōu)。

補腎健脾;尾部懸吊;模擬失重;骨丟失;骨組織形態(tài)計量學

隨著航天事業(yè)的不斷發(fā)展，航天員在進入太空后引起的一系列生理適應性反應問題逐漸被人們所關(guān)注。在太空環(huán)境中，由于失重的原因使作用于人體的重力負荷消失，機體的活動減少，從而導致骨質(zhì)的丟失，它是航天飛行過程中最常見的病理改變之一［1-3］。現(xiàn)今仍然沒有一種有效的辦法來解決這一醫(yī)學問題。中醫(yī)學認為“腎主骨，脾主四肢”、“脾腎相關(guān)”，脾和腎對機體骨量的調(diào)節(jié)具有重要的作用。據(jù)此，本研究通過尾部懸吊大鼠建立失重條件下骨丟失模型，探討補腎、健脾和補腎健脾方藥對模擬失重大鼠股骨形態(tài)計量學的作用，為航天失重性骨丟失提供有效防護措施。

1 材料

1.1 動物

SPF/VAF級健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(180±10)g，購于北京維通利華實驗動物中心(許可證號SCXK(京)2006-0009)。

1.2 藥材與試劑

補腎方由鹿茸、淫羊藿等組成，健脾方由生曬參、生黃芪等組成，補腎健脾方由生曬參、生黃芪、鹿茸、淫羊藿等組成，全部藥材購自北京同仁堂遼寧有限責任公司(批號1001206020)。全部藥材經(jīng)本校中藥教研室老師鑒定均符合國家《藥典》標準。方中鹿茸打碎過100目篩兌入藥液，3個方中其余藥物均采用常規(guī)水煎煮法提取，將所得全部藥液混合依次濃縮成0.42 g原藥材/mL、0.56 g原藥材/mL、1g原藥材/mL濃度備用。骨鈣素ELISA法檢測試劑盒，武漢華美生物工程有限公司(批號120915)。

1.3 儀器

美國 Luna r雙能 X線骨密度分析儀;德國Leica DMLA顯微照相系統(tǒng);德國Leica硬組織切片機;奧地利Anthos 2010酶標儀。

2 方法

2.1 分組及處理

50只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、懸吊組、補腎組、健脾組和補腎健脾組5組各10只。依據(jù)人和動物間體表面積折算的等效劑量比值表計算大鼠給藥劑量，補腎組、健脾組、補腎健脾組大鼠從實驗第1天開始依次按2.4 g·kg-1·d-1、3.2 g· kg-1·d-1、5.7 g·kg-1·d-1給予補腎方、健脾方和補腎健脾方灌胃，其余各組大鼠灌服等容積的生理鹽水。除正常組外其余各組大鼠采用頭低位-30°尾部懸吊法［4］模擬失重，每天懸吊24 h共懸吊21d;正常組大鼠不做任何處理。實驗第21天各組大鼠稱重，于灌胃后2 h后水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，離心留取血清，-20℃冷凍保存。并取雙側(cè)股骨和右側(cè)脛骨，-80℃冷凍保存。

2.2 檢測指標及方法

2.2.1 血清骨鈣素(Osteocalcine，OC)測定ELISA法測定血清骨鈣素，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.2.2 股骨骨密度測定 取各組大鼠右側(cè)股骨，除凈附著其上的肌肉和軟組織，生理鹽水沖洗，用雙能X射線骨密度分析儀測定大鼠離體右側(cè)股骨的骨密度，骨密度值以單位面積的骨礦物質(zhì)含量(g·cm-2)表示。

2.2.3 股骨骨形態(tài)計量學參數(shù)測定 取各大鼠左側(cè)股骨，10%中性甲醛固定，70%～100%酒精梯度脫水，塑料包埋切片，厚度7μm，Von kossa染色。全自動顯微鏡50倍視野下觀察股骨形態(tài)并采集圖像。取切片中心部的5個視野測量并取其平均數(shù)，Image Pro Plus6.0軟件測量骨小梁面積比(Tb. Ar)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

2.2.4 脛骨組織形態(tài)學觀察 取各大鼠右側(cè)脛骨，10%中性甲醛固定流水沖洗，避光下用10% EDTA溶液進行脫鈣處理，至骨組織軟化后流水沖洗，70%～100%酒精梯度脫水，石蠟包埋切片，厚度5 μm，HE染色，全自動顯微鏡50倍視野下觀察脛骨形態(tài)并采集圖像。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，單因素方差分析后行組間比較，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 補腎、健脾、補腎健脾三方對尾部懸吊模型大鼠血清骨鈣素含量的影響

表1顯示，與正常組比較，懸吊組大鼠血清骨鈣素含量明顯降低(P＜0.01);與懸吊組比較，補腎組、健脾組、補腎健脾組大鼠血清骨鈣素含量明顯升高(P＜0.01);與補腎健脾組比較，健脾組大鼠血清骨鈣素含量降低(P＜0.05)。

3.2 補腎、健脾、補腎健脾三方對尾部懸吊模型大鼠股骨骨密度的影響

表1顯示，與正常組比較，懸吊組大鼠股骨骨密度明顯降低(P＜0.01);與懸吊組比較，補腎組和補腎健脾組大鼠股骨骨密度明顯升高(P＜0.01)，健脾組大鼠股骨骨密度升高(P＜0.05);與補腎健脾組比較，補腎組大鼠股骨骨密度降低(P＜0.05)，健脾組大鼠股骨骨密度明顯降低(P＜0.01)。

表1 補腎、健脾、補腎健脾三方對尾部懸吊大鼠血清骨鈣素含量和股骨骨密度的影響(±s，n=10)

表1 補腎、健脾、補腎健脾三方對尾部懸吊大鼠血清骨鈣素含量和股骨骨密度的影響(±s，n=10)

注:與正常組比較:2)P＜0.01;與懸吊組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與補腎健脾組比較:5)P＜0.05，6)P＜0.01

組別 骨密度(g·cm-1) 骨鈣素(μg·L-1)正 常 組0.130±0.004 6.534±0.250懸 吊 組 0.103±0.0032) 3.858±0.1482)補 腎 組 0.117±0.0064)5) 5.209±0.2334)健 脾 組 0.111±0.0033)6) 4.853±0.0864)5)補腎健脾組 0.122±0.0064) 5.841±0.1314)

3.3 補腎、健脾、補腎健脾三方對尾部懸吊大鼠股骨骨形態(tài)計量學參數(shù)的影響

圖1表2顯示，與正常組比較，懸吊組大鼠股骨Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均顯著降低(P＜0.01)，Tb.Sp顯著升高(P＜0.01);與懸吊組比較，補腎組和補腎健脾組大鼠股骨Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N顯著升高(P＜0.01)，Tb.Sp明顯降低(P＜0.01);健脾組大鼠股骨Tb.Ar和Tb.Th顯著升高(P＜0.01)，Tb.N升高(P＜0.05)，Tb.Sp降低(P＜0.05);與補腎組健脾組比較，補腎組大鼠股骨Tb.Ar和Tb.Th下降(P＜0.05)，Tb.Sp升高(P＜0.05);健脾組大鼠股骨Tb.Ar(P＜0.05)下降，Tb.Th明顯下降(P＜ 0.01)，Tb.Sp升高(P＜0.05)。

表2 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠股骨骨形態(tài)計量學參數(shù)的影響(±s，n=5)

表2 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠股骨骨形態(tài)計量學參數(shù)的影響(±s，n=5)

注:與正常組比較:2)P＜0.01;與懸吊組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與補腎健脾組比較:5)P＜0.05，6)P＜0.01

組別Tb.Ar(%) Tb.Th(μm) Tb.N(mm) Tb.Sp(μm)正 常 組 31.28±2.09 76.66±4.33 4.18±0.28 211.41± 9.08懸 吊 組 15.22±0.782) 52.49±2.892) 2.82±0.272) 267.09± 8.072)補 腎 組 23.61±3.314)5) 65.61±4.064)5) 3.59±0.404) 238.31± 9.224)5)健 脾 組 22.62±1.454)5) 63.92±2.944)6) 3.32±0.333) 248.11±98.443)5)補 腎健脾 組 27.35±2.344) 70.43±2.114) 3.88±0.234) 226.37± 7.304)

圖1 各組大鼠股骨von kossa染色

圖2 各組大鼠脛骨HE染色

3.4 補腎、健脾、補腎健脾三方對模擬失重大鼠脛骨組織形態(tài)學的影響

圖2顯示，各組大鼠脛骨HE染色可見，正常組大鼠骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，排列致密有序;與正常組比較，懸吊組大鼠骨小梁斷裂，數(shù)量明顯減少，排列稀疏;與懸吊組比較，補腎組和健脾組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)改善，數(shù)量明顯增加、排列有序，補腎健脾組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)明顯改善，排列有序成網(wǎng)狀。

4 討論

研究表明，人類在進入太空后失重環(huán)境會導致骨質(zhì)丟失，骨質(zhì)丟失一般發(fā)生在腰椎、股骨、脛骨、盆骨等特定部位。航天失重所造成的骨質(zhì)丟失嚴重影響了航天作業(yè)和航天員返回地面的適應能力，必須采取有效的措施來解決這一問題［5］。中醫(yī)學認為，“腎藏精，主骨生髓”、“脾主運化，主四肢，在體合肌肉”、“腎為先天之本，脾為后天之本”，骨的生長、發(fā)育和衰弱等都與腎精的盛衰和脾氣的充盛有密切關(guān)系。已有學者研究表明，補腎中藥對失重性骨丟失具有明顯的改善作用［6］。本研究采用目前國內(nèi)外公認的大鼠尾部懸吊模型模擬失重［4］，依據(jù)中醫(yī)對失重性骨丟失的病機認識選用補腎健脾方藥進行防治，觀察該方中補腎中藥、健脾中藥以及全方對尾部懸吊大鼠股骨和脛骨骨形態(tài)學的影響，以期獲得防治失重性骨丟失的有效方藥。

血清骨鈣素由成骨細胞產(chǎn)生和分泌，能直接反映骨的形成狀況，具有骨代謝調(diào)節(jié)激素的作用，其合成受1.25(OH)2D3調(diào)節(jié)，當發(fā)生失重性骨質(zhì)疏松時，破骨細胞功能增強，成骨細胞功能減弱，1.25 (OH)2D3合成下降，OC合成低下［7-8］。失重性骨丟失是以骨形成減少為主導的骨質(zhì)疏松，中長期載人航天數(shù)據(jù)表明，航天員在太空飛行180 d過程中，確實出現(xiàn)了血清骨鈣素水平降低的現(xiàn)象［9］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，懸吊組大鼠血清骨鈣素含量較正常組顯著下降，表明尾部懸吊21 d大鼠骨形成減少，與以往其他研究小組的研究結(jié)果一致［10］。補腎方藥、健脾方藥和補腎健脾方藥均能顯著升高大鼠血清骨鈣素含量，說明3個方劑對失重性骨丟失大鼠骨更新率有明顯的改善作用，且補腎健脾方藥作用明顯。

當發(fā)生骨質(zhì)疏松時骨密度降低，骨組織形態(tài)學發(fā)生相應改變，其中骨小梁面積百分率、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量降低，骨小梁分離度增高，骨組織形態(tài)變得稀疏無規(guī)律［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，懸吊組大鼠股骨骨密度降低，股骨骨形態(tài)計量學參數(shù)變化以及脛骨HE染色結(jié)果均表明，尾部懸吊21 d大鼠發(fā)生了骨質(zhì)疏松。補腎方藥、健脾方藥、補腎健脾方藥可明顯升高股骨骨密度、骨小梁面積百分率、骨小梁厚度和骨小梁數(shù)量，顯著降低骨小梁分離度。本課題組之前的研究也表明［12］，3個方劑可以升高脛骨骨密度，提示對于尾部懸吊模擬失重導致的脛骨和股骨骨丟失，3個方劑均有不同程度的作用，而以補腎健脾方藥作用最優(yōu)，但其具體調(diào)節(jié)骨代謝的作用機制，如對甲狀旁腺素、降鈣素和1.25(OH)2D3影響還有待于進一步探討。

［1］Smith S M，Wastney M E，O’Brien K O，et al.Bone markers，calcium metabolism，and calcium kinetics during extendedduration space flight on the Mir space station［J］.J Bone Miner Res，2005，20(2):208-218.

［2］Sibonga J D，Cavanagh P R，Lang T F，et al.Adaptation of the skeletal system during long-duration spaceflight［J］.Clinic Rev BoneMiner Metabol，2008，5(4):249-261.

［3］董頎，沈羨云.失重飛行對骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能的影響［J］.現(xiàn)代臨床醫(yī)學生物工程學雜志，2005，1(3):167-169.

［4］Morey-Holton E R，Globus R K.Hindlimb unloading rodent model:technical aspects［J］.J Appl Physiol，2002，92(4): 1367-1377.

［5］張林，范穎，陳文娜，等.補腎、健脾和補腎健脾方對尾部懸吊大鼠腰椎骨丟失的作用研究［J］.山西中醫(yī)學院學報，2012，13(3):37-39.

［6］朱斌，郭華，郝喜娟，等.失重性骨質(zhì)疏松的發(fā)生機制及中藥對其防治作用的研究進展［J］.中國骨傷，2012，25(7):611-616.

［7］李平生，韋興，殷亞昕，等.骨質(zhì)疏松癥骨代謝生化指標與骨密度測量分析［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2005，11(1):22-24.

［8］王攀，王冰，楊志，等.失重性骨質(zhì)疏松與老年性骨質(zhì)疏松比較［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2005，26:22-24.

［9］Caillot-Augusseau A，Vico L，Heer M，et al.Space flight is associated with rapid decreases of undercarboxylated osteocalcin and increases of markers of bone resorption without changes in their circadian variation:observations in two cosmonauts［J］. Clin Chem，2000，46(8):1136-1143.

［10］麥燕興，黃震，簡煉，等.模擬失重與骨組織的細胞凋亡［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(46):8585-8589.

［11］賴阿娜，楊銳，張振，等.雷尼酸鍶對尾懸吊大鼠骨組織形態(tài)計量學的影響［J］.解放軍醫(yī)學雜志，2011，36(6):666-668.

［12］張林，范穎，陳文娜，等.補腎、健脾和補腎健脾方對尾部懸吊大鼠鈣、磷代謝的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19 (12):193-196.

Effects of Tonifying Kidney and Invigorating Spleen Prescription on the Bone Histomorphometry in Rat Tail Suspension Model

WANG Jun-yan，ZHANG Lin△，HE Xin-yong，CHEN Wen-na，KONG Ling-dong，JIA Bo
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China)

Objective:To investigate the effect of tonifying kidney prescription，invigorating spleen and tonifying kidney and invigorating spleen prescription on the bone histomorphometry of tail-suspended rat.Methods:50 male Wistar rats were randomly divided into five groups:the normal group，the suspension group，the tonifying kidney group，the invigorating spleen group and tonifying kidney and invigorating spleen group.Except the normal group rats，The remaining rats were suspended by head down tilt-30°for 21 days.Rats in the tonifying kidney group，the invigorating spleen group and tonifying kidney and invigorating spleen group were orally administrated with three decoctions and other groups with equivalent saline.Experiment 21 days，Osteocalcine was detected by ELISA method;Bone mineral density was measured using dual energy X ray absorptiometry，Through Silver nitrate staining of femur，HE staining of Tibial bone to observe the morphology of Bone tissue.Result:Compared with the normal group，The suspension group serum osteocalcin was significantly lower，femur bone mineral density was significantly lower，the trabecular bone area，trabecular thickness and trabecular number of femur bone were significantly lower，Trabecular separation significantly higher，trabecular obviously sparse of Tibial bone;Compared with the suspension group，the indexes of the tonifying kidney group，the invigorating spleen group and tonifying kidney and invigorating spleen group has improved significantly，and the tonifying kidney and invigorating spleen group improved obviously.Conclusion:Tonifying kidney prescription，invigorating spleen and tonifying kidney and invigorating spleen have protective effect on the simulated weightlessness induced bone loss，can effectively improve the bone histomorphometry parameters，and the effecs of the tonifying kidney and invigorating spleen prescrpition was obvious.

Tonifying kidney and invigorating spleen;Tail-suspended;Simulated weightlessness;Bone loss;Bone histomorphomet

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1404-03

2015-03-23

國家自然科學基金資助項目(81001493);教育部博士點新教師基金(20102133120001);遼寧中醫(yī)藥大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310162057);遼寧省高等學校杰出學者成長計劃項目(LT2014103)

王俊巖(1992-)，男，遼寧營口人，在讀碩士，從事中醫(yī)藥的臨床與研究。

△通訊作者:張 林(1977-)，女，河北吳橋人，副教授，碩士研究生導師，從事方劑效用機理與配伍規(guī)律研究，Tel:024-31207085，E-mail:zhanglin770622@hotmail.com。