李瑞雪王鈺婷胡 飛王 偉高新文汪泰初

（1安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥 230061；2江蘇科技大學，江蘇鎮(zhèn)江 212003；3安徽省農業(yè)科學院植保研究所，安徽合肥 230000）

·試驗研究·

桑樹總黃酮含量變化規(guī)律分析

李瑞雪1，2王鈺婷1胡 飛3王 偉1高新文1汪泰初1

（1安徽省農業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥 230061；2江蘇科技大學，江蘇鎮(zhèn)江 212003；3安徽省農業(yè)科學院植保研究所，安徽合肥 230000）

采用Al（NO3）3－NaNO2分光光度比色法，綜合不同桑樹品種、桑樹不同部位以及不同季節(jié)等因素，分析桑樹總黃酮含量的變化規(guī)律，為富含總黃酮藥食用途桑品種育種及其開發(fā)利用提供生物資源。結果表明，4個桑屬22個桑品種桑葉的總黃酮含量差異極顯著（P＜0.01），含量變幅為25.79～63.14 mg／g，湖桑199桑葉總黃酮含量最高，雜選花葉桑葉總黃酮含量最低；皖桑1號等5個桑樹品種不同季節(jié)桑葉的總黃酮含量以春季最高，夏季最低，差異顯著（P＜0.05）；同一季節(jié)桑葉的總黃酮含量，遠高于枝條、樹干基部樹皮等部位，差異極顯著（P＜0.01）；樹干基部樹皮總黃酮含量顯著高于枝條（P＜0.05）。

桑品種；桑葉；枝條；樹干；樹皮；比色法；總黃酮；富集規(guī)律

我國是世界蠶桑生產(chǎn)的發(fā)源地，自然生態(tài)環(huán)境復雜多樣，形成了豐富的桑樹品種，有著極大的桑樹資源優(yōu)勢。除了桑葉可用于飼喂家蠶，桑皮還可以造紙，桑椹可食用，其葉、枝、果、根皮等均可以入藥［1］?，F(xiàn)有研究表明，桑樹含有種類豐富的化學成分［2－4］，具有降血糖、降血壓、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性及藥理作用［5－8］，其中黃酮類化合物就是其主要的功能成分之一［9－11］，也是衡量桑、蠶藥用價值的重要指標之一，一直是國內外研究的熱點。

隨著食品化學工業(yè)的發(fā)展和大眾消費觀念的轉變，由天然活性物質做成的保健食品成為現(xiàn)代人尋求的目標，其中黃酮類化合物以高活性、見效快、綠色天然、作用廣泛等特點，日益受到人們的關注。目前研究較多的產(chǎn)黃酮類物質的植物主要有銀杏、大豆、茶葉、葛根等植物［12－13］，種類不多，資源較稀少，不能滿足市場的需要。而有研究表明，桑樹幾乎各個部位都含有桑黃酮成分，且含量較高，不同桑品種總黃酮類在桑葉的含量高達44.00～55.38 mg／g［14］。受桑品種、桑樹部位、采收季節(jié)和發(fā)育階段等因素的影響，總黃酮成分含量存在很大的差異［15－17］，盡管目前有較多關于桑樹總黃酮成分含量變化的研究報道，但這些報道僅是考慮單一或部分因素的測定結果，難以真實反映其變化規(guī)律，因此有必要綜合多種影響因素進行更加全面系統(tǒng)的分析。

本試驗挑選了22個典型的桑品種，分別測定了其新梢桑葉中的總黃酮含量，并系統(tǒng)探討了皖桑1號等6個桑品種不同季節(jié)桑葉、皖桑1號等4個桑品種不同部位總黃酮含量的變化規(guī)律，以期為深入研究總黃酮在桑樹體內的富集和轉化規(guī)律，更有效地開發(fā)利用桑樹黃酮類物質資源，更好地開發(fā)桑樹的藥食用價值提供有用的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試桑樹樣品 供試的4個桑屬22個桑品種的桑樹樣品均采自于安徽省桑樹品種選育中心10～15年生的桑樹，品種分別是雞桑屬（Morus aust?ralis Poir.）的屏邊雞桑，魯桑屬（Morus multicaulis Perr.）的皖桑1號、皖桑2號、皖桑優(yōu)1號、華明桑、7707、紅星5號、逆水千曲、強桑1號、湖桑32、孿枝桑、金寨龍桑、新大葉瓣、昌盛、魯扦1號、晉桑9號、雜選花葉，山桑屬（Morus mongolica Bur.）的劍持，白桑屬（Morus alba Linn.）的農桑8號、湖桑199、湘7920。于2013年10月中旬分別采摘皖桑1號等22個桑品種的桑葉，于2014年分期采摘春（4月中旬）、夏（7月中旬）、秋（10月中旬）3個季節(jié)皖桑1號、皖桑2號、皖桑優(yōu)1號、華明桑、紅星5號和強桑1號6個桑品種的桑葉，于2014年10月中旬分別采摘皖桑1號、皖桑2號、皖桑優(yōu)1號和強桑1號4個桑品種的桑葉，桑枝頂部、中部和基部的枝條，桑樹主干基部的樹皮。所有樣品的桑葉均選取桑樹當年生枝條中部的葉片，桑枝條均選取當年生各部位的長約2 cm的枝條，桑樹主干基部的樹皮均選取主干貼地面部位約2 cm2的樹皮。將采集的所有桑樹樣品經(jīng)DHG電熱恒溫鼓風干燥箱55℃烘干至恒質量，經(jīng)超微粉碎機粉碎后過100目篩，4℃低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 蘆丁標準品（純度＞99%），購自于Sigma公司；乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設備 UV－1700紫外分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；DHG電熱恒溫鼓風干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；超微粉碎機，榮德精密科技股份有限公司產(chǎn)品；FA1204N分析天平，上海民橋精密科學儀器有限公司產(chǎn)品；電子恒溫水浴鍋，上海啟前電子科技有限公司產(chǎn)品；臺式冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 測定樣品液的制備 稱取以上桑葉、桑枝不同部位及桑樹主干樣品各0.2 g，分別以1∶30體積比用80%乙醇提取，置于80℃水浴中提取120 min；在8 000 r／min的條件下離心20 min，取上清液加80%乙醇定容至6 mL，得樣品總黃酮待測液，備用，各樣品設3個重復。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制 精確稱取蘆丁標準品10 mg，加適量80%乙醇使其溶解，定容于50 mL容量瓶中，搖勻，得0.2 g／L蘆丁標準品對照液；精確量取蘆丁標準品對照液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于25 mL容量瓶中，補加80%乙醇至5 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，用80%乙醇稀釋至25 mL，搖勻，得蘆丁對照液；在吸光度最大的510 nm處，測定其吸光度。

1.2.3 總黃酮含量測定 采用Al（NO3）3－NaNO2分光光度比色法［16］測定提取液中的總黃酮含量。取待測液1 mL，置于25 mL容量瓶中，加80%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻后放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻后放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10 mL，以80%乙醇定容至25 mL，混勻，放置15 min，在吸光度最大的510 nm處，測定其吸光度，每個樣品重復測定3次，取平均值，計算總黃酮含量?？傸S酮含量（mg／g）＝（X×25.00× 0.006 0）／0.20，其中X＝（Y－0.005 3）／10.889 0，Y為吸光度，X為提取液總黃酮濃度。

1.2.4 精密度和重復性試驗 按“1.2.1”的方法制備皖桑1號桑葉總黃酮提取液，平行制備5份，按“1.2.3”的方法檢測計算總黃酮含量及相對標準偏差（RSD），重復5次。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗 取皖桑1號桑葉總黃酮提取液，分別間隔0、10、15、20、25、30、35、40 min后，按“1.2.3”的方法測定其吸光值，重復5次，計算分析其總黃酮含量。

1.2.6 回收率測定 分別精確稱取已知總黃酮含量的皖桑1號桑葉烘干粉末5份樣品（約2 g／份），按“1.2.1”的方法制備桑葉總黃酮提取液，精確加入質量濃度為0.2 mg／mL的蘆丁標準品溶液1 mL，按“1.2.3”的方法測定，重復5次，計算其加樣回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)處理采用Excel和SPSS19.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析，均以平均值±標準差（ˉx±s）表示，采用Duncan多重比較法進行差異顯著性多重比較。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準工作曲線和回歸方程

以標準品對照液質量濃度為X軸，以吸光度為Y軸，繪制標準曲線，經(jīng)線性擬合建立總黃酮吸光度（Y）與標準品對照液質量濃度（X）之間的線性回歸方程：Y＝10.889 0 X＋0.005 3，R2＝0.999 8，蘆丁標準品質量濃度在4～400 μg／mL范圍內與吸光度顯現(xiàn)良好的線性關系（圖1）。

圖1 蘆丁標準工作曲線

2.2 不同桑樹品種桑葉的總黃酮含量比較

從表1看，4個桑屬22個桑品種桑葉的總黃酮含量差異極顯著（P＜0.01），含量變幅為25.79～63.14 mg／g，桑葉總黃酮質量分數(shù)超過50.00 mg／g的有6份，其中湖桑199和皖桑2號2個品種中桑葉總黃酮的質量分數(shù)最高，分別高達63.14 mg／g和58.57 mg／g；桑葉總黃酮質量分數(shù)在30.00 mg／g以下的有2份，雜選花葉的桑葉總黃酮質量分數(shù)最低，為25.79 mg／g；其余14個桑品種的桑葉總黃酮質量分數(shù)在30.00～50.00 mg／g之間，可作為桑樹藥食用品種的育種素材或直接用作桑葉藥食用產(chǎn)品的開發(fā)利用。

表1 不同桑品種桑葉的總黃酮含量情況

2.3 不同季節(jié)桑葉的總黃酮含量變化

從不同季節(jié)桑葉的總黃酮含量變化情況（圖2）可以看出，皖桑1號、皖桑2號、皖桑優(yōu)1號、華明桑、紅星5號和強桑1號6個桑品種中，除華明桑外，皖桑1號等5個桑品種不同季節(jié)桑葉總黃酮含量的變化趨勢是一致的，夏季桑葉的總黃酮質量分數(shù)顯著低于春季和秋季桑葉的總黃酮質量分數(shù)（P＜0.05），平均為33.52 mg／g，春季和秋季桑葉的總黃酮質量分數(shù)無顯著差異（P＞0.05），其中春季最高，平均為52.10 mg／g，這是因為夏季溫度過高或是環(huán)境中光輻射較強，抑制了黃酮成分的合成積累［18－19］。華明桑秋季桑葉的總黃酮質量分數(shù)高于春季桑葉的總黃酮質量分數(shù)，分別為52.90 mg／g和45.76 mg／g。

圖2 2014年不同季節(jié)桑葉的總黃酮含量變化情況

2.4 桑樹不同部位的總黃酮含量變化

從同一季節(jié)桑樹不同部位的總黃酮含量情況（圖3）可以看出，皖桑1號、皖桑2號、皖桑優(yōu)1號和強桑1號4個桑品種桑樹不同部位的總黃酮含量變化趨勢一致，桑葉的總黃酮平均質量分數(shù)最高，為42.30 mg／g，遠高于枝條各部位、樹干基部樹皮等部位，差異極顯著（P＜0.01）；皖桑2號桑葉的總黃酮質量分數(shù)最高，達58.57 mg／g；樹干基部樹皮的總黃酮質量分數(shù)顯著高于枝條各部位的總黃酮質量分數(shù)（P＜0.05），其總黃酮平均質量分數(shù)為18.27 mg／g；枝條上部、中部、下部的總黃酮質量分數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 桑樹不同部位的總黃酮含量情況（2014年10月）

2.5 精密度和重復性測試結果

5次測定皖桑1號的桑葉總黃酮含量，結果見表2，相對標準偏差為0.28%，說明采用Al（NO3）3－NaNO2分光光度比色法測定樣品總黃酮含量的方法可行性好，精密度高，重復性好。

表2 精密度和重復性測試結果

2.6 穩(wěn)定性測試結果

將桑葉總黃酮提取液經(jīng)顯色反應后于4℃放置不同時間，分別測定不同時間點樣品的總黃酮含量，結果見表3，在20 min以內，桑葉提取液的總黃酮含量是穩(wěn)定的，隨著時間的增加，總黃酮含量明顯降低，相對標準偏差為4.23%，表明提取液經(jīng)顯色反應后穩(wěn)定性較差，試驗中需盡快完成檢測。

表3 穩(wěn)定性測試結果

2.7 回收率測試結果

在桑葉總黃酮提取液中加入一定量蘆丁標準品進行總黃酮回收率測定，結果見表4；由表4可知，桑葉總黃酮的平均加樣回收率為99.96%，其相對標準偏差為0.88%。

表4 桑葉總黃酮加樣回收率測試結果

3 小結與討論

本試驗采用Al（NO3）3－NaNO2分光光度比色法，綜合考慮不同桑品種、桑樹不同部位、不同季節(jié)等因素，對桑樹總黃酮含量的變化規(guī)律進行了探討分析，為富含總黃酮藥食用途桑品種育種及其開發(fā)利用提供生物資源。該方法操作簡便、精密度高、重復性好，適宜于總黃酮含量的測定。試驗結果表明，魯桑、白桑、山桑、雞桑等4個桑屬22個桑品種桑葉的總黃酮含量差異極大（P＜0.01），含量變幅為25.79～63.14 mg／g，湖桑199桑葉的總黃酮含量最高，雜選花葉桑葉的總黃酮含量最低，與劉利等［14］的測定結果相近，比李平平等［20］的測定結果高；除華明桑外，皖桑1號等5個桑品種不同季節(jié)桑葉的總黃酮含量以春季最高，夏季最低，且差異顯著（P＜0.05），另有研究表明，桑葉11月份經(jīng)霜后，桑葉的總黃酮含量會繼續(xù)上升至最高，超過春季桑葉的總黃酮含量［21］；同一季節(jié)桑葉的總黃酮含量遠高于枝條各部位、樹干基部樹皮等部位，且差異極顯著（P＜0.01），樹干基部樹皮總黃酮含量顯著高于枝條各部位（P＜0.05）；由于試驗選材桑樹品種未能統(tǒng)一，海拔對桑樹總黃酮含量的影響規(guī)律及合成積累機制還需進一步研究。

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陜西省安康市蠶種場（封面）

中國農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所附屬蠶藥廠（封二）

云南省農業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所（封三）

江蘇生久農化有限公司（封底）

涼山州蠶種場（彩插1）

南潯菱湖寶成蠶業(yè)用品廠（彩插2）

西昌市蠶種場（彩插3）

山東省寧陽縣蠶用化工廠（彩插4）

廣東寶桑園蠶業(yè)有限公司（彩插5）

湖州市蠶業(yè)技術推廣站（彩插6）

《中國蠶業(yè)》征訂啟事（P7）

《蠶業(yè)科學》征訂啟事（P14）

《蠶桑茶葉通訊》征訂啟事（P37）

《北方蠶業(yè)》征訂啟事（P56）

《農產(chǎn)品質量與安全》征訂啟事（P61）

《中國蠶業(yè)》投稿信箱重要聲明（P69）

《特種經(jīng)濟動植物》征訂啟事（P82）

浙江省嵊州市蠶種場（P97）

四川省南充蠶具研究有限公司（P98）

S888.2

B

1007－0982（2015）04－0030－05

2015－08－11；接受日期：2015－09－20

安徽省農業(yè)科學院青年創(chuàng)新基金項目（編號14B0638）；現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（編號CARS－22）；安徽省農業(yè)科學院種子工程項目（編號15D0605）；安徽省農業(yè)科學院創(chuàng)新團隊項目（編號11C0610）。

李瑞雪（1982—），女，山東濟寧，碩士，助理研究員。

Tel：0551－62842195，E?mail：li－ruixue＠163.com

汪泰初（1970—），男，研究員。

Tel：0551－62842195，E?mail：18949853828＠189.com