張 康，龔振華，林祥超，郭光禮，杜 翔，王麗萍，于建敏，李金平，侯廣宇，單 虎

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109；3.青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266032；4.臨朐縣畜牧局，山東 臨朐 262600）

馬立克氏?。∕arek's Disease，MD）野毒株多年來(lái)一直在不斷地變異[1]。1922年美國(guó)報(bào)道發(fā)生MD，雞死亡率達(dá)20%，這一時(shí)期的馬立克氏病毒表現(xiàn)為內(nèi)臟器官出現(xiàn)淋巴腫瘤。50年代起，“急性MD毒株”對(duì)于養(yǎng)雞業(yè)的危害已經(jīng)比較嚴(yán)重，MD開(kāi)始出現(xiàn)暴發(fā)，不僅僅是神經(jīng)病變，內(nèi)臟淋巴腫瘤性病變也較多，死亡率超過(guò)30%[2]。到了1970年開(kāi)始推廣使用疫苗，MD得到了控制[3]。1980年以來(lái)，MDV進(jìn)一步變異。1990年，出現(xiàn)毒力更強(qiáng)的野毒株，可以突破經(jīng)HVT－血清型Ⅱ型病毒株聯(lián)苗和CVI988/Rispens疫苗免疫的雞群，引起免疫雞發(fā)生MD[4]。

近年來(lái)，我國(guó)MD野外流行毒株毒力不斷增強(qiáng)，這一問(wèn)題在臨床方面表現(xiàn)得比較突出。我們對(duì)某雞場(chǎng)送檢的疑似感染馬立克氏病的病死雞進(jìn)行了診斷，從病死雞中分離到一株超強(qiáng)馬立克氏病毒株，并進(jìn)行了基因序列和致病性分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物。本研究所用的試驗(yàn)雞由SPF雞胚（濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司）孵化。

1.1.2 馬立克病毒參考毒株。超強(qiáng)馬立克病毒株SD2012-1[5]（GenBank中檢索號(hào)KC511815）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 疫苗。HVT疫苗，批號(hào)：獸藥生字（2010）100082001。CVI988疫苗，批號(hào)：JC241。

1.1.4 試劑。DNA純化試劑盒、Taq DNA 聚合酶、pGM-T、感受態(tài)細(xì)胞。

1.1.5 引物。采用文獻(xiàn)[5]報(bào)道的擴(kuò)增馬立克氏病毒meq基因的引物，F(xiàn)：5＇-CCGTCTAGAAGGCG GGCACGG TAC-3＇，R：5＇ -CGGAAGCTT AAACATGGGGCATAGACG-3＇。分析野毒株SD2012-1與CVI988疫苗株的meq基因序列可知，SD2012-1片段擴(kuò)增長(zhǎng)度預(yù)期為1081bp。CVI988/Rispens疫苗株片段擴(kuò)增長(zhǎng)度預(yù)期為1255bp。

1.2 方法

1.2.1 病死雞的處理。解剖某雞場(chǎng)送檢的病死雞，記錄每只病死雞的病理變化特征，取其病變的肝、心、肺、脾和腎等，備用。

1.2.2 病毒的細(xì)胞分離。按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞[6]。將病死雞的羽髓剪碎，加入適量的PBS進(jìn)行研磨，低速離心后取上清，用濾器除菌過(guò)濾，再將濾液加入單層的雞胚成纖維細(xì)胞，37℃孵育30 min后，加入培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況。

1.2.3 PCR檢測(cè)。提取分離病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物、CVI988/Rispens疫苗的DNA。按照參考文獻(xiàn)[7]，進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)馬立克氏病病毒的DNA。95℃ 5 min 預(yù)變性，94℃ 1min 變性、53℃ 1min退火，72℃ 2min延伸，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min完全延伸。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.4 相關(guān)致瘤基因meq的測(cè)序。膠回收分離馬立克氏病毒的meq基因擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行克隆。meq基因擴(kuò)增產(chǎn)物連接于pGM-T 載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，篩選meq重組質(zhì)粒。選取陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙脫氧法DNA測(cè)序。

1.2.5 病毒感染動(dòng)物試驗(yàn)。將1日齡的SPF雞共分7組，每組30只，分別是未免組、常規(guī)劑量HVT組、常規(guī)劑量CVI988組、常規(guī)劑量HVT+CVI988組、10×常規(guī)劑量HVT組、10×常規(guī)劑量CVI988 組和10×常規(guī)劑量HVT+CVI988組，各個(gè)試驗(yàn)組在雞出殼后24h內(nèi)用相應(yīng)疫苗和劑量進(jìn)行免疫。將細(xì)胞分離的該馬立克氏病毒進(jìn)行蝕斑純化。用純化的病毒腹部皮下接種7日齡試驗(yàn)雞，劑量為2000PFU/羽份。至90d結(jié)束試驗(yàn)。試驗(yàn)期間記錄攻毒后雞的臨床發(fā)病情況。

2 結(jié)果

2.1 剖檢死雞的結(jié)果

病死雞病理癥狀明顯，與典型的MD病癥狀相同。肝臟表面有散在的白色腫瘤結(jié)節(jié)，脾臟破裂并有纖維素性滲出，腺胃乳頭出血和腸道出血，見(jiàn)圖1。

2.2 病毒的細(xì)胞分離結(jié)果

雞羽髓的組織提取物在雞胚成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)5d后開(kāi)始出現(xiàn)局部性的病變，表現(xiàn)為輕微細(xì)胞脫落和細(xì)胞聚集。繼續(xù)傳至3代后，病毒感染后第3d開(kāi)始形成蝕斑，表現(xiàn)為細(xì)胞堆積，中心區(qū)域融合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并伴有細(xì)胞脫落如圖2（B），未接種病毒的健康細(xì)胞未出現(xiàn)病變?nèi)鐖D2（A）。

圖1 病死雞的內(nèi)臟器官出現(xiàn)的病變

圖2 分離病毒在CEF產(chǎn)生的病變（PI 72h）

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

SD2012-1株擴(kuò)增出特異性目的條帶，與預(yù)期長(zhǎng)度大小1081bp相符。CVI988疫苗株擴(kuò)增的特異性目的條帶，與預(yù)期長(zhǎng)度大小1255bp相符。陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶如圖3。該分離病毒株擴(kuò)增的特異性目的條帶與SD2012-1大小一致，其大小為1081bp見(jiàn)圖3。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.4 病毒株的meq基因的測(cè)定結(jié)果

該分離株（ZC2014）的meq基因的ORF大小為1020bp。與CVI988、SD2012-1的meq基因（GenBank中檢索號(hào)為DQ530348 、KC511815）同源性都為99%。

2.5 病毒感染試驗(yàn)雞的結(jié)果

未免組、常規(guī)劑量HVT組和10×常規(guī)劑量HVT組的發(fā)病率分別為80.0%、73.0%和76.6%。常規(guī)劑量CVI988組和10×常規(guī)劑量CVI988組的發(fā)病率分別為30.0%和30.0%。常規(guī)劑量HVT+CVI988組和10×常規(guī)劑量HVT+CVI988組的發(fā)病率分別為26.6%和26.7%。

3 討論

MDV分為3個(gè)血清型：血清型Ⅰ型、血清型Ⅱ型和血清型Ⅲ型[8]。其中只有MDV-1擁有meq基因[9]。由于目前認(rèn)為meq具有轉(zhuǎn)錄激活因子和調(diào)控病毒DNA復(fù)制的功能，MDV-1的強(qiáng)弱毒株在致瘤性上的不同與其meq基因有關(guān)[10]。而且近年來(lái)發(fā)現(xiàn)MDV-1的meq基因的長(zhǎng)度并不相同。CVI988的meq全長(zhǎng)392個(gè)氨基酸，有些馬立克超強(qiáng)毒株的meq在194～252位點(diǎn)缺少58個(gè)氨基酸，通過(guò)在缺失端的兩端設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以將野毒株與CVI988疫苗株進(jìn)行區(qū)分。本研究中我們PCR擴(kuò)增SD2012和ZC2015擴(kuò)增大小為1081bp，而該P(yáng)CR擴(kuò)增CVI988DNA長(zhǎng)度為1255bp，臨床上采用該P(yáng)CR方法可以將野毒株與疫苗株進(jìn)行區(qū)分。

其他研究又表明，MDV的meq基因在575～577位置表現(xiàn)出變異。疫苗毒株V1988/Rispens 和814均缺失了meq 基因ORF中的第575～577位的3 個(gè)堿基（CAC），而屬?gòu)?qiáng)毒株的GA株（vMDV）、648A（vv+MDV）、中國(guó)的2個(gè)野毒株N株和G2株在這個(gè)位點(diǎn)則完全保持不變。韋平等人又對(duì)4個(gè)廣西MD陽(yáng)性病例的腫瘤病料中獲得的MDV 基因組DNA 進(jìn)行meq 基因擴(kuò)增、測(cè)序時(shí)，也獲得了與強(qiáng)毒株相同的結(jié)果[10]。序列分析發(fā)現(xiàn)，我們的分離株ZC2014比疫苗株CVI988/Rispens的meq序列在第575～577位多插入3個(gè)堿基（CAC），與SD2012-1相同。

圖4 各MDV-1毒株meq基因核苷酸序列對(duì)比

圖5 各MDV-1毒株meq基因的氨基酸序列比較

用病毒感染試驗(yàn)雞，未免組的、常規(guī)劑量HVT組和10×常規(guī)劑量HVT組的發(fā)病率分別為80.0%、73.3%和76.6%，HVT不能對(duì)該毒株產(chǎn)生免疫保護(hù)。常規(guī)劑量CVI988組和10×常規(guī)劑量CVI988組的發(fā)病率分別為30.0%和30.0%，常規(guī)劑量HVT+CVI988組和10×常規(guī)劑量HVT+CVI988組的發(fā)病率分別為26.6%和26.7%，CVI988疫 苗 和HVT+CVI988聯(lián)苗可以為攻毒雞群提供部分免疫保護(hù)。HVT+CVI988聯(lián)苗免疫效果比單獨(dú)免疫CVI988疫苗稍好。從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果來(lái)看，建議雞場(chǎng)按常規(guī)劑量將HVT疫苗和CVI988疫苗聯(lián)合使用，對(duì)雞群進(jìn)行免疫。

本項(xiàng)目通過(guò)細(xì)胞分離病毒、meq致瘤基因的序列分析和攻毒免疫保護(hù)試驗(yàn)確證分離到一株超強(qiáng)馬立克氏病毒株。野外MDV毒力變異不斷增強(qiáng)，臨床防控馬立克氏病則更困難，所以當(dāng)前的MD防治應(yīng)依靠疫苗、建立快速檢測(cè)方法及改善雞的飼養(yǎng)環(huán)境等。

表1 各組雞在試驗(yàn)期間的死亡數(shù)、存活雞腫瘤發(fā)生數(shù)和發(fā)病率等情況統(tǒng)計(jì)

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