胡永芳 張匯征 劉家秀 林一民 譚克輝

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·論著·

耐多藥肺結(jié)核患者血CD4細(xì)胞計數(shù)及痰菌分離鑒定和藥物敏感性試驗分析

胡永芳 張匯征 劉家秀 林一民 譚克輝

結(jié)核, 肺； CD4淋巴細(xì)胞計數(shù)； 革蘭陰性菌； 微生物敏感性試驗

耐多藥肺結(jié)核(MDR-PTB)是指肺結(jié)核患者感染的Mtb經(jīng)體外證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥[1]。MDR-PTB日趨增多，已成為肺結(jié)核防治的極大障礙，如合并呼吸道感染就更加棘手。各種感染性疾病的轉(zhuǎn)歸與細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)，尤其是與T淋巴細(xì)胞功能的關(guān)系更加密切[2]。筆者回顧分析489例MDR-PTB患者CD4細(xì)胞和痰中病原菌及藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結(jié)果，探討CD4細(xì)胞與MDR-PTB患者呼吸道感染的相關(guān)性，為制定治療方案提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

資料和方法

一、 臨床資料

收集重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心2013年1月至2014年8月住院治療的489例經(jīng)痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性、藥敏試驗證實為MDR-PTB，伴咳嗽、咯痰加重、出現(xiàn)肺部啰音或啰音增多、或(和)發(fā)熱，行血常規(guī)和影像學(xué)檢查支持呼吸道感染者，排除重癥監(jiān)護、呼吸機輔助呼吸者，以及血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、HIV抗體陽性等免疫功能低下者，其中男350例，女139例，年齡范圍13～85歲，平均年齡(40.04±15.03)歲。

206例患者痰標(biāo)本鏡下檢查每低倍視野中白細(xì)胞>25個、上皮細(xì)胞<10個且白細(xì)胞有吞噬病菌或與病菌并存現(xiàn)象、培養(yǎng)出相應(yīng)菌為病原菌組，其余283例患者則為無病原菌組。

二、方法

1.主要儀器和試劑：CD4細(xì)胞檢測采用美國BD公司流式細(xì)胞儀(FACSCount)、專用試管及配套試劑。微生物分析系統(tǒng)為美國德靈公司產(chǎn)品及配套鑒定及藥敏試驗板、輔助試劑，有關(guān)藥敏試驗紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品，血平板、嗜血桿菌平板、麥康凱平板和真菌培養(yǎng)平板等均購自重慶龐通公司。

2.標(biāo)本采集與處理：按CD4細(xì)胞檢測要求采集患者靜脈血2.0 ml，防止凝集及溶血；不能立即檢測者可4 ℃保存24 h。在醫(yī)護人員指導(dǎo)下，患者留取合格痰標(biāo)本置于無菌容器中并在2 h內(nèi)送檢。

3.方法：CD4細(xì)胞檢測按照試劑盒說明書，采用流式細(xì)胞儀MutiSET軟件自動分析計數(shù)，計數(shù)單位：個/μl，本室參考值為414～1123 個/μl。按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[3]推薦程序進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，采用美國德靈微生物分析系統(tǒng)對分離菌株進(jìn)行鑒定及藥敏試驗。采用抑制增強紙片法確認(rèn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)菌株，葡萄球菌體外耐甲氧西林的檢測用K-B法頭孢西丁進(jìn)行確認(rèn)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、白色念珠菌ATCC10231，均由重慶市臨床檢驗中心提供。

三、 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、患者外周血CD4細(xì)胞檢測結(jié)果

489例患者CD4細(xì)胞總檢測結(jié)果在30～1894(438±258)個/μl；無病原菌組為86～1894(514±273)個/μl，38.5%(109/283)低于本室參考值下限；病原菌組為30～935(340±194)個/μl，75.7%(156/206)低于本室參考值下限。兩組CD4細(xì)胞平均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=8.23，P<0.01)。將CD4細(xì)胞每100個/μl作為一個區(qū)間，不同CD4細(xì)胞區(qū)間兩組平均年齡和患者分布比較見表1。

二、痰普通病原菌分布

489例患者283例無病原菌，206例培養(yǎng)出病原菌244株，其中革蘭陰性桿菌123株、真菌63株、革蘭陽性球菌58株，詳見表2。大腸埃希菌6株、肺炎克雷伯菌5株、陰溝腸桿菌2株產(chǎn)ESBLs，檢出率5.3%(13/244)；金黃色葡萄球菌6株、凝固酶陰性葡萄球20株耐甲氧西林，檢出率為10.7%(26/244)。在CD4<400個/μl區(qū)間病原菌感染者154例，占病原菌組的74.8%(154/206)，即大多數(shù)低于本室參考值下限。單一真菌35例，3例CD4≤200個/μl、12例201個/μl≤CD4≤400個/μl、10例401個/μl≤CD4≤600個/μl、10例CD4>600個/μl。細(xì)菌合并真菌28例，其中17例CD4≤200個/μl和7例201個/μl≤CD4≤400個/μl，4例分散在其他區(qū)間。

三、主要病原菌對常用抗菌藥物藥敏試驗結(jié)果

多數(shù)革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類100.0%敏感, 對阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星敏感率均在50.0%以上，對哌拉西林、頭孢噻肟耐藥嚴(yán)重；革蘭陽性球菌對達(dá)托霉素、利奈唑胺、萬古霉素均100.0%敏感，對青霉素、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢曲松耐藥率均在60.0%以上(表3，4)。

表1 不同CD4細(xì)胞區(qū)間病原菌組和無病原菌組平均年齡和患者分布比較

表2 244株病原菌分布和構(gòu)成比

注 其他真菌包括近平滑念珠菌、毛霉菌、隱球菌、煙曲菌

表3 常用抗菌藥物對主要革蘭陰性桿菌的耐藥率(%)

注 括號中分?jǐn)?shù)為“對某一類菌做某一抗生素藥敏試驗時，耐藥菌株數(shù)與全部菌株數(shù)之比”

表4 常用抗菌藥物對主要革蘭陽性球菌的耐藥率(%)

注 括號中分?jǐn)?shù)為“對某一類菌做某一抗生素藥敏試驗時，耐藥菌株數(shù)與全部菌株數(shù)之比”

討 論

結(jié)核分枝桿菌引起的免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞免疫，以CD4+T淋巴細(xì)胞為主，它激活效應(yīng)細(xì)胞，使其他免疫細(xì)胞聚集于感染部位以增強宿主免疫反應(yīng)[4]。相當(dāng)一部分MDR-TB患者存在細(xì)胞免疫功能低下[5]，MDR-PTB患者在抗結(jié)核治療時還大量使用糖皮質(zhì)激素，免疫功能被進(jìn)一步抑制。本研究中患者血CD4細(xì)胞普遍偏低，病原菌組低于無病原菌組，兩組CD4細(xì)胞平均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=8.23，P<0.01)。表1顯示病原菌組74.8%(154/206)在CD4<400個/μl以下，除CD4<100個/μl、301個/μl≤CD4<400個/μl區(qū)間外兩組患者分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；病原菌組平均年齡明顯大于無病原菌組(t=5.70，P<0.01)。細(xì)菌、細(xì)菌合并真菌感染者所占比率有隨CD4細(xì)胞減少而增多的趨勢，但不同CD4細(xì)胞區(qū)間表現(xiàn)不完全相同。CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的多少是機體免疫狀態(tài)的最好體現(xiàn)，機體主要通過CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫激活巨噬細(xì)胞,直接或間接增強殺菌效應(yīng)[6]。病原菌組患者CD4細(xì)胞少,難以依靠細(xì)胞免疫清除病原菌；呼吸系統(tǒng)疾病大多數(shù)患者都與免疫功能降低有關(guān)，而且免疫功能降低，又容易發(fā)生感染[7]；老年人胸腺退化，淋巴細(xì)胞亞群組成及活性等均降低，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能下降[8]，易患各種感染性疾??；無病原菌組CD4細(xì)胞相對較多，一定程度上可以靠自身細(xì)胞免疫清除病原菌，少數(shù)未被清除但達(dá)不到痰中病原菌判定標(biāo)準(zhǔn)而被視為無病原菌。檢測MDR-PTB血CD4細(xì)胞，可作為評估患者免疫力狀況、預(yù)防、治療、合理有效干預(yù)呼吸道感染的參考。

MDR-PTB患者痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)持續(xù)陽性，導(dǎo)致患者呼吸道免疫力低下，容易發(fā)生呼吸道感染[9]；患者多合并支氣管擴張、肺部多發(fā)空洞、肺纖維化、胸膜增厚等諸多肺部病變，需要長時間的治療，進(jìn)一步增加了呼吸道感染的可能性[10]。如發(fā)生呼吸道感染，病情迅速惡化，采取有效措施積極處理對病情好轉(zhuǎn)意義重大。本研究中痰普通病原菌以革蘭陰性桿菌為主(50.4%)，肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼-溶血不動桿菌、大腸埃希菌居前5位，前4位主要存在于呼吸道或為醫(yī)院感染重要病原菌，大腸埃希菌是腸道正常寄生菌，移居腸道外為機會致病菌。其次為真菌(25.8%)和革蘭陽性球菌(23.8%)，真菌感染率明顯高于其他相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[11]，以白色念珠菌為主；因患者應(yīng)用抗生素種類多、時間長而致菌群失調(diào)使真菌大量繁殖。革蘭陽性球菌中表皮葡萄球菌比率高，可能與抗生素使用不規(guī)范擾亂自身平衡所致， ESBLs、MRSA、MRCNS等多重耐藥菌的產(chǎn)生與長期使用廣譜抗生素、濫用抗生素相關(guān)，造成臨床治療困難，應(yīng)引起高度重視。

痰普通細(xì)菌藥敏試驗結(jié)果顯示：前5種革蘭陰性桿菌除銅綠假單胞菌外未發(fā)現(xiàn)對碳青霉烯類耐藥，表3顯示：多數(shù)革蘭陰性桿菌對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星較敏感，對哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢曲松耐藥嚴(yán)重。肺炎克雷伯菌對其他抗生素耐藥率較低；陰溝腸桿菌對妥布霉素、左氧氟沙星等多種抗生素耐藥率為45.0%～55.0%，對其他6種抗生素耐藥率較低；銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥率為70.6%，對其他抗生素耐藥率較低；鮑曼-溶血不動桿菌對本中心常用抗生素耐藥率普遍較低；大腸埃希菌對多種抗生素100.0%耐藥。阿米卡星也是二線抗結(jié)核藥物，雖可作為經(jīng)驗治療首選抗生素，但由于其腎毒性較大，應(yīng)慎重使用。ESBLs菌株會產(chǎn)生抗生素滅活酶，可裂解頭孢菌素類和青霉素類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，使其喪失抗菌活性，因此β-內(nèi)酰胺類抗生素應(yīng)與相應(yīng)酶抑制劑聯(lián)合使用而發(fā)揮抗菌作用。美洛培南對革蘭陰性桿菌廣泛敏感，在所檢測抗生素中抗菌活性最強，可作為治療耐藥菌重癥感染首選藥物。碳青霉烯類常引起肝腎功能損傷、胃腸道反應(yīng)等多種不良反應(yīng)，不建議經(jīng)驗性使用。革蘭陽性球菌對青霉素、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢曲松等耐藥嚴(yán)重，對復(fù)方新諾明、利福平、四環(huán)素、慶大霉素敏感率相對較高。未發(fā)現(xiàn)對達(dá)托霉素、利奈唑胺、萬古霉素耐藥菌株，萬古霉素不良反應(yīng)多且嚴(yán)重，不推薦首選使用。MRSA、MRCNS具有多耐藥和強耐藥性，與第3代頭孢菌素和碳青霉烯類的濫用有關(guān)。菌株的來源、培養(yǎng)條件、使用抗生素等情況不同而耐藥性不同；即便菌種相同，但在不同醫(yī)院或者地區(qū)的耐藥性也會不同；臨床醫(yī)生應(yīng)了解流行菌株耐藥性，合理使用抗生素。

目前，有關(guān)CD4+T淋巴細(xì)胞與MDR-PTB患者痰中病原菌相關(guān)性研究未見報道，蔡青山、毛良平、宋曉東等[9-10,12]只作了MDR-PTB呼吸道感染痰普通細(xì)菌及藥敏試驗結(jié)果分析，且收集的病例資料較少；我們收集了較多病例資料，在CD4+T淋巴細(xì)胞與痰中普通病原菌同步檢測結(jié)果趨勢和意義作了研究，為本研究的獨到之處。

綜上所述，MDR-PTB患者存在以CD4細(xì)胞下降為突出表現(xiàn)的細(xì)胞免疫受損，易合并呼吸道感染，痰中病原菌菌株多元化, 耐藥廣泛而復(fù)雜，嚴(yán)重困擾著患者的治療。檢測T淋巴細(xì)胞亞群評估細(xì)胞免疫功能已成為各種感染性疾病診斷及治療監(jiān)測的一項重要手段[2]；建議建立CD4淋巴細(xì)胞、呼吸道病原菌及藥敏試驗常規(guī)監(jiān)測,以便為患者制定個性化治療方案提供參考，使其得到及時有效治療。此外，本研究為回顧性研究，未對性別、病程、營養(yǎng)狀況等因素是否影響研究結(jié)果作進(jìn)一步分析，有待今后繼續(xù)收集病例作相應(yīng)的研究。

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(本文編輯：范永德)

CD4 cell count,sputum bacteria isolation identification and its drug sensitivity test of resistance in multi-drug resistant pulmonary tuberculosis patients

HUYong-fang,ZHANGHui-zheng,LIUJia-xiu,LINYi-min,TANKe-hui.

LaboratoryDepartmentofChongqingMunicipalPublicHealthTreatmentCenter，Chongqing400036,China

LINYi-min,Email：lym_001@aliyun.com；TANKe-hui,Email: 403724868@qq.com

Tuberculosis, pulmonary； CD4 lymphocyte count； Gram-negative bacteria； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.007

400036 重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心檢驗科(胡永芳、張匯征、劉家秀)；重慶市腫瘤研究所檢驗科(林一民)；重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校(譚克輝)

林一民，Email：lym_001@aliyun.com；譚克輝,Email: 403724868@qq.com

2014-11-11)