金真 王康麗 梁佳惠 梁樹樂

摘要：為獲得高效的適合‘章姬草莓莖尖培養(yǎng)的技術方案，試驗通過不同培養(yǎng)基和外源激素對‘章姬草莓莖尖培養(yǎng)的研究，建立其組培快繁體系，結(jié)果表明：在不同的處理中，最適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式如下：（1）剝?nèi)〉那o尖越大，萌發(fā)率越高。（2）在改良White培養(yǎng)基配方+蔗糖40 g/L，pH 5.8的培養(yǎng)基培養(yǎng)下的莖尖成活率最高（80%）。（3）綜合增殖系數(shù)與增殖苗的品質(zhì)等多重因素獲得增殖培養(yǎng)適合培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L，增殖系數(shù)為3.8。（4）生根培養(yǎng)基以1/2MS+蔗糖30g/L為宜。采用各項最適的方案進行‘章姬草莓的培養(yǎng)，可以達到優(yōu)質(zhì)高效的目的。

關鍵詞：草莓；章姬；莖尖培養(yǎng)

中圖分類號：S668.4 文獻標志碼：A 論文編號：2014-0643

0 引言

草莓是薔薇科（Rosoideae）草莓屬（Fragaria L.）多年生草本植物，果實酸甜可口，營養(yǎng)豐富，是經(jīng)濟價值較高的天然高檔食品，市場需求量極大，中國已成為栽培草莓最多的國家之一。草莓是靠匍匐莖進行無性繁殖的作物，經(jīng)過幾代繁殖之后，容易感染多種病毒而患病?；疾〉牟葺L緩慢、葉片皺縮、果實小而畸形、品質(zhì)變差，并且病情逐年加重。在國內(nèi)已造成損失的草莓病毒主要有草莓斑駁病毒（SMoV）、草莓輕型黃邊病毒（sMYEV）、草莓鑲脈病毒（SVBV）、草莓皺縮病毒（SCrV）等4種。草莓植株一旦感染病毒，通過常規(guī)的藥劑很難進行防治，這極大地制約了草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

由于國內(nèi)對草莓病毒病的研究起步較晚，關于草莓病毒病方面一些研究內(nèi)容仍顯不足。目前草莓無病毒苗的培育方法，主要有熱處理法、花藥培養(yǎng)法和莖尖組織培養(yǎng)法等。其中莖尖培養(yǎng)不僅可以有效脫除病毒，而且可以快速繁殖、工廠化培育草莓苗，對草莓新品種的推廣起重要作用。近幾年來這一領域的研究已經(jīng)有較多報道，也建立了一些重要草莓品種的生產(chǎn)技術體系。不過，在草莓無病毒苗工廠化生產(chǎn)過程中，依然存在著增殖速度慢、培養(yǎng)進程長等缺陷。

為了取得較好的脫毒效果，在保證成活的前提下盡量切取較小的莖尖生長點，生長點太小也增加培養(yǎng)的難度，所以微莖尖的啟動培養(yǎng)是莖尖脫毒培養(yǎng)的關鍵環(huán)節(jié)，文獻上也多有報道，但方法不一，培養(yǎng)基的外源激素的種類及濃度差異較大。此外，微環(huán)境的控制對莖尖的培育也有很大的影響，Kozai等研究表明，改變組培微環(huán)境使其更接近自然條件，有利于移栽的試管苗加速馴化。

‘章姬草莓在國內(nèi)栽培面積大，據(jù)中國園藝協(xié)會草莓分會的統(tǒng)計顯示，2011年‘章姬在中國的栽培面積超過4300 hm²，位列主栽品種第7位?？s短周期從脫毒苗獲取的數(shù)量而言能達到成倍的增加，因此，探究草莓脫毒技術對草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。試驗以莖尖培養(yǎng)法為基礎，通過探究不同培養(yǎng)基及激素組合，以期得到高效的適合‘章姬草莓莖尖培養(yǎng)的技術方案。

1 材料與方法

供試材料采自中國農(nóng)業(yè)大學（煙臺）學?；?，選擇草莓品種‘章姬6—9月萌發(fā)的草莓匍匐莖作為試驗材料，此階段匍匐莖要求生長充實，小葉尚未展開，剪取4～5 cm長的匍匐莖頂部。

1.1 材料的滅菌消毒

先用洗潔精洗刷草莓匍匐莖表面污物及絨毛，再用流水沖洗30 min～1 h。在超凈操作臺上，將沖洗后的材料留匍匐莖2～3 cm長，先后用75%酒精消毒30 s、用0.1%的升汞溶液消毒6～7 min，并分別用無菌水沖洗3～5次。

1.2 莖尖的剝離與培養(yǎng)

將消毒后的草莓匍匐莖用鑷子夾到經(jīng)過高壓滅菌的盛有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于雙筒解剖鏡下，剝離幼葉，切取不同大小的莖尖，保留1～2個葉原基以提高莖尖的成活率。將切取后的莖尖立即置于莖尖啟動培養(yǎng)基上，蔗糖30 g/L，經(jīng)121℃壓力滅菌15 min后置于溫度25℃，光照1500～2000 1x、日照時數(shù)16 h的培養(yǎng)條件下進行啟動培養(yǎng)。試驗采用6組培養(yǎng)基，按GA、IBA、6-BA、NAA、IAA等激素進行不同濃度的配比，維持培養(yǎng)基pH 5.8，并附加有蔗糖30～40 g/L，瓊脂6～7.5 g/L。培養(yǎng)基的組成分別如下：①MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA0.2 m/L+GA 0.5 mg/L+蔗糖30/L；②MS+6-BA0.5 m/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30/L；③MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.05 m/L+蔗糖30 g/L；④MS+6-BA1.0 m/L+GA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L；⑤改良White培養(yǎng)基+蔗糖40 g/L；⑥MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L。

1.3 增殖與生根培養(yǎng)

切取無根植株轉(zhuǎn)入以MS為基本培養(yǎng)基，增加不同生長素和細胞分裂素濃度，pH 5.8的培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，每20天轉(zhuǎn)換1次培養(yǎng)基。

取增殖后生長健壯的無根植株插入1/2 MS+蔗糖30 g/L，pH 5.8，瓊脂6～7.5/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2周后上述無根植株100%生根，3周后，根系的長度均≥2 cm，達到移栽對根系的要求。

1.4 試管苗的移栽

將根系長度超過2 cm的植株，移栽于穴盤，基質(zhì)成分為德國大漢草炭土：珍珠巖=2：1，觀察其煉苗移栽情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖大小對成活率的影響

從草莓‘章姬品種的匍匐莖上分別剝?nèi)　?.2、0.2～0.4、≥0.4 mm大小的莖尖，采用啟動培養(yǎng)基MS+GA0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L進行莖尖的培養(yǎng)，2周后，莖尖生長至1 mm，剝?nèi)∏o尖的大小直接影響莖尖的成活率，結(jié)果如表1。莖尖越大，成活率越高，反之，莖尖越小，成活率越低。在同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，莖尖≤0.2 mm的成活率僅為20%，莖尖≥0.4mm的成活率達75%，莖尖0.2～0.4mm成活率為62.5%。通過SSR法進行顯著性檢驗后可以更直觀地得出，莖尖i>0.4 mm的成活率顯著高于莖尖0.2～0.4 mm的成活率，極顯著高于莖尖≤0.2 mm的成活率，而0.2～0.4 mm的莖尖成活率也極顯著高于≤0.2 mm莖尖的成活率。從脫毒的角度來看，在保證外植體成活的前提下，莖尖的生長點應越小越好。

根據(jù)激素對植物影響的不同，將有利于莖尖啟動的各種激素進行配比，探究最優(yōu)的啟動培養(yǎng)基，從表2中可以得出，以⑤改良White培養(yǎng)基+蔗糖40g/L，pH 5.8，加入瓊脂6～6.5 g/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)下的莖尖成活率最高，達80%，經(jīng)顯著性檢驗后也可以得出應用此培養(yǎng)基培養(yǎng)的莖尖成活率極顯著高于其他培養(yǎng)基。⑤培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基中的有機物和鐵源配方，其他配方均采用原White培養(yǎng)基配方。⑤培養(yǎng)基中僅含激素IAA，且無機鹽濃度相對MS培養(yǎng)基較低，蔗糖濃度相對較高。①MS+GA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+蔗糖30g/L培養(yǎng)基的莖尖成活率僅次于⑤，達65%，顯著高于②培養(yǎng)基，極顯著高于其他培養(yǎng)基，與培養(yǎng)基④以及空白對照培養(yǎng)基⑥相比，可以得出，適宜濃度的激素IBA對莖尖的成活有促進作用。培養(yǎng)基②莖尖成活率也比較高，達55%，極顯著高于其他培養(yǎng)基，與培養(yǎng)基③以及空白對照培養(yǎng)基⑥相比可得，在莖尖啟動培養(yǎng)時，高濃度的6-BA在一定程度上對莖尖的成活產(chǎn)生了一定的抑制作用。已啟動的莖尖生長點呈現(xiàn)鮮嫩的綠色，每4周更換1次新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方不變，3個月后，莖尖可生長分化成直徑3～5 cm的芽叢。

2.2 增殖培養(yǎng)

采用表3的不同的培養(yǎng)基組合，觀察到在相同的低濃度的NAA條件下，隨著6-BA濃度的增加，增殖系數(shù)增大，但在①6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.05 mg/L的培養(yǎng)下，出現(xiàn)玻璃化苗加重，畸形苗多，并且隨著繼代次數(shù)的增多，玻璃化苗有加重的趨勢。當在②6-BA 1.0 mg/L、NAA0.05 mg/L時，幼苗的玻璃化現(xiàn)象有所減輕，只零星出現(xiàn)玻璃化苗。而在③MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L中，草莓苗生長健壯，沒有玻璃化苗出現(xiàn)的情況，經(jīng)30天左右轉(zhuǎn)換1次新鮮培養(yǎng)基，增殖系數(shù)能達到3.8，也可以滿足生產(chǎn)的要求。

2.3 組培苗的生根培養(yǎng)

鄧群仙等采用不同的培養(yǎng)基配方進行生根誘導后，得出最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+蔗糖30g/L和1/2 MS+IBA0.2 mg/L+蔗糖30g/L。試驗對此2種培養(yǎng)基做進一步的探究，2周后調(diào)查生根情況，試驗結(jié)果（表4）表明，同樣作為根系誘導的高效配方，不添加激素的培養(yǎng)基①1/2 MS+蔗糖30 g/L對根系的誘導反而高于添加激素的培養(yǎng)基②1/2MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 gm，并且無激素苗根系生長健壯。

2.4 試管苗的移栽

當生根培養(yǎng)的植株根系長到2 cm時，將瓶放到溫室中進行1～2天煉苗，然后打開瓶蓋，在瓶中加入少量清水，2天后洗凈根系培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)成分為德國大漢草炭土+珍珠巖（2：1）中，上方蓋塑料薄膜保濕，根據(jù)氣候及溫度情況加蓋遮蔭網(wǎng)，植株生長健壯，成活率可達90%以上。

3 結(jié)論

研究表明，剝?nèi)∏o尖的大小對莖尖的成活率有明顯的影響，剝?nèi)〉那o尖越大，莖尖的成活率越高；培養(yǎng)基的激素配比對莖尖的成活也有很大的影響，在改良White培養(yǎng)基、蔗糖40 gm、pH 5.8的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的莖尖，成活率高達80%，該配方對莖尖的誘導效果顯著優(yōu)于其他配方；試驗研究表明，6-BA濃度對幼苗的增殖系數(shù)有很大的影響，在0.5-2.0mg/L范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，增值系數(shù)增大，但高濃度高增殖系數(shù)條件下的幼苗玻璃化嚴重，品質(zhì)變劣，綜合增殖系數(shù)與增殖苗的品質(zhì)等多重因素獲得增殖培養(yǎng)適合的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L；生根培養(yǎng)基以1/2 MS+蔗糖30g/L為宜，在此條件下，根系生長健壯，利于幼苗的生長?？刹捎蒙鲜龈黜椬钸m的方案進行‘章姬草莓莖尖的優(yōu)化培養(yǎng)。

4 討論

4.1 外植體的滅菌與脫毒

在草莓莖尖培養(yǎng)過程中，表面消毒是組培成功的前提，嚴格控制75%酒精滅菌的時間，不要超過30 s，同時用0.1%升汞滅菌6～7 min，以達到最佳的滅菌效果。此滅菌方法與夏瑾等的研究結(jié)果相符。這樣既保證外植體的滅菌效果，也減少對材料的傷害，從而提高莖尖成活率，保證莖尖的質(zhì)量。

植物病毒在植物體內(nèi)主要沿著輸導組織蔓延發(fā)展，由于莖尖沒有導管和篩管的分化，頂端分生組織一般沒有病毒，離頂端越遠，病毒侵入的可能性越大。取材過小，會增加剝離和培養(yǎng)的難度。何歡樂等試驗所用的冷處理、熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒方法，獲得的試管苗脫毒率可達100%，但剝?nèi)〉那o尖都為0.5 mm大小，且溫度處理對莖尖均存在不同程度的傷害，較難控制。因而要保證莖尖免受逆境脅迫的前提下，試驗中要可切取適當大小的莖尖，以取材0.2～0.4mm為宜。

4.2 低鹽環(huán)境與莖尖的成活

雖然花藥和葉片作為外植體分化率也很高，董莉等利用葉片作為外植體誘導率達到了90%。但草莓莖尖培養(yǎng)不需要形成愈傷和再分化，培養(yǎng)時間較短，變異率低，是一條非常有價值的組織培養(yǎng)快繁途徑。本試驗以‘章姬草莓莖尖為外植體，在初代培養(yǎng)基⑤的培養(yǎng)條件下，莖尖成活率高達80%。試驗中所應用的⑤培養(yǎng)基較之MS基本培養(yǎng)基而言，無機鹽濃度相對較低，其高成活率可能與低鹽環(huán)境有密不可分的關系，經(jīng)過試驗觀察，筆者認為低鹽環(huán)境可能對莖尖的滲透作用影響較小，有利于莖尖的誘導成活，在這方面前人未有提及。

4.3 幼苗玻璃化的規(guī)避

試管苗玻璃化現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)中普遍發(fā)生的特有的一種生理性病變，草本植物更易出現(xiàn)玻璃化。草莓屬于草本植物，在組織培養(yǎng)的過程中也常出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，前人多是通過一些影響草莓組培苗玻璃化的單因子試驗來研究草莓組培苗玻璃化的問題。增加培養(yǎng)基中細胞分裂素6-BA的濃度，草毒試管苗的玻璃化率有明顯的提高，這與李海剛對牡丹和趙佐敏對非洲菊的研究相似。Kevers等認為，玻璃化的發(fā)生較易受到培養(yǎng)基中的細胞分裂素的影響。因細胞分裂素而引起的玻璃化苗，往往具有蓮節(jié)短、分枝多等特點。這可能是因為細胞分裂素促進細胞的分裂，細胞大量生長。此外，據(jù)Gaspar報道，大量的乙烯產(chǎn)生于石竹試管苗玻璃化過程中，乙烯在玻璃苗中的產(chǎn)生量在各個階段總是高于正常苗的乙烯產(chǎn)生量，但當乙烯以及乙烯前體ACC在組培容器中的含量提高時不會誘導玻璃苗的產(chǎn)生，這表明可能不是因為乙烯的大量產(chǎn)生而誘發(fā)組培苗玻璃化的發(fā)生。因而，玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)也可能與植物體多代培養(yǎng)時內(nèi)源激素的累積有關，內(nèi)源激素的累積導致植物生長后期品質(zhì)變劣，營養(yǎng)元素供應不上，生長勢弱，抵抗力差，從而表現(xiàn)出玻璃化。

在增殖培養(yǎng)中，研究發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的增加，組培苗玻璃化程度加重。當6-BA 2.0 mg/L時，增殖系數(shù)很高，但苗細、黃弱，玻璃化嚴重。6-BA濃度高而引起組培苗玻璃化并且褐化是草莓組培中較常出現(xiàn)又較難解決的問題，往往易造成組培苗死亡率過高，性狀難以穩(wěn)定。為有效規(guī)避草莓幼苗玻璃化現(xiàn)象，研究表明，草莓繼代增殖的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L，，這與牟彤等的研究結(jié)果相符。本試驗在繼代培養(yǎng)時，通過減少細胞分裂素水平，逐步降低6-BA的濃度，或者轉(zhuǎn)接到MS空白培養(yǎng)基中過渡，再轉(zhuǎn)到含有低濃度細胞分裂素的培養(yǎng)基中，既保證了較高的增殖系數(shù)，又獲得了健壯的種苗為后期的移栽做準備。

4.4 外源激素與生根培養(yǎng)

很多研究表明，添加激素有利于發(fā)根，但是本試驗研究結(jié)果表明，不添加激素的1/2MS+蔗糖30g/L培養(yǎng)基不僅能夠同樣滿足草莓苗生根的要求，而且根系粗壯，須狀根系少，有利于后期的移栽成活，同時也減少了幼苗因長期的激素富集而引起的質(zhì)量下降；而添加激素的1/2 MS+IBA0.2 mg/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基培養(yǎng)的幼苗，其根系細弱、密集，從試管苗的繼代與移栽成活的角度考慮是不利的。