曹欣宇 梁圖雅 齊志欣 斯琴其木格 格日勒?qǐng)D

摘 要：為研究自然放牧條件下不同月齡烏珠穆沁肉羊的股二頭肌、肱三頭肌、背最長肌3 個(gè)部位骨骼肌肌內(nèi)脂肪相關(guān)基因的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)測定肉羊生長過程中過氧化物酶體增殖劑激活受體γ亞型（peroxisome proliferator activated receptors，PPARγ）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）相關(guān)基因（PPARγ、FAS）表達(dá)量。結(jié)果表明：兩種基因表達(dá)量在各部位骨骼肌上的趨勢相近。PPARγ基因的表達(dá)量在1月齡和12月齡較高，9月齡和18月齡較低；FAS基因的表達(dá)量在3月齡和12月齡較高，

9月齡和18月齡較低。通過對(duì)基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性分析可以得出，PPARγ基因和FAS基因的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：肉羊；肌內(nèi)脂肪；PPARγ基因；FAS基因

Expression of Genes Related to Intramuscular Fat Content in Wuzhumuqin Sheep under Natural Grazing Conditions

CAO Xinyu， LIANG Tuya， QI Zhixin， Siqinqimuge， BORJIGIN Gerelt*

（College of Food Science and Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018，China）

Abstract： To investigate the relationship between intramuscular fat contents and the related genes， biceps femoris （BF）， triceps brachii （TB） and longissimus dorsi （LD） muscles were obtained from naturally grazing Wuzhumuqin sheep， and gene expression related to intramuscular fat contents were measured by real-time polymerase chain reaction （PCR）. The results showed that the expression patterns of the peroxisome proliferator activated receptors （PPARγ） and fatty acid synthase （FAS） genes were similar in the three skeletal muscles. The PPARγ gene was highly expressed at 1 and 12 months of age but lowly expressed at 9 and 18 months of age， whereas the FAS gene was highly expressed at 3 and 12 months of age and also lowly expressed at 9 and 18 months of age. The correlation analysis revealed that there was a negative correlation between intramuscular fat contents and the expression of the PPARγ and FAS genes in skeletal muscle.

Key words： sheep； intramuscular fat； PPARγ gene； FAS gene

中圖分類號(hào)：Q812 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2015）07-0025-05

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201507006

羊肉具有膽固醇含量低，營養(yǎng)價(jià)值高，味美多汁等品質(zhì)特點(diǎn)[1-2]而受到廣大群眾的喜愛。影響羊肉品質(zhì)的因素有很多，其中肌內(nèi)脂肪含量是一個(gè)重要因素，肌肉不同部位脂肪含量的高低直接影響羊肉的風(fēng)味、嫩度、多汁性等。肌內(nèi)脂肪含量由年齡、環(huán)境、飼養(yǎng)以及肌內(nèi)脂肪相關(guān)基因等多種因素來決定。參與基因調(diào)控的主要物質(zhì)有過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）[3-5]和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）。PPARs包括PPARα、PPARβ、PPARγ 3種亞型[4，6]，能調(diào)控脂肪基因的表達(dá)并能使其脂肪細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)脂類代謝相關(guān)基因和參與脂肪的吸收、運(yùn)輸、形成和分解過程[7]。FAS是機(jī)體內(nèi)合成脂肪途徑中的一個(gè)關(guān)鍵性的酶。FAS的表達(dá)可增加在體內(nèi)甘油三酯的沉積而導(dǎo)致肥胖[8]。兩種基因的表達(dá)在不同品種及不同骨骼肌組織中脂肪沉積存在著差異性。張長慶等[9]研究指出PPARγ基因在不同部位脂肪組織和肌肉組織中均有表達(dá)且部位不同而表達(dá)量具有差異性。Lee等[10]

研究指出PPAR基因的相對(duì)表達(dá)量在韓國牛27月齡的表達(dá)與其在12月齡時(shí)的韓國牛的相對(duì)表達(dá)量相比有3倍的關(guān)系。Clarke等[11]研究指出用高碳水化合物的日糧能提高其肝臟中FAS基因的表達(dá)，而高蛋白的日糧飼喂會(huì)降低FAS基因的表達(dá)。QiaoYong等[12]用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測肌肉中FAS基因表達(dá)的發(fā)育性變化，發(fā)現(xiàn)FAS mRNA水平在新疆細(xì)毛羊和哈薩克羊肌肉中的發(fā)育模式各有不同，F(xiàn)AS基因mRNA的表達(dá)量與哈薩克羊肌內(nèi)脂肪含量負(fù)相關(guān)。由于季節(jié)不同肉羊采食的牧草不同，肉羊在不同季節(jié)和生長階段中肌內(nèi)脂肪含量大不相同。梁圖雅等[13]對(duì)烏珠穆沁肉羊不同月齡不同部位骨骼肌脂肪含量等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，在此基礎(chǔ)上本研究對(duì)自然放牧條件下烏珠穆沁肉羊不同月齡、不同骨骼肌部位的肌內(nèi)脂肪相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行分析，更加深入的探討自然放牧條件下季節(jié)變換對(duì)肉羊生長過程中肌內(nèi)脂肪的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬季出生并自然放牧條件的1、3、6、9、12、18月齡烏珠穆沁肉羊中各選3只。屠宰后采取股二頭肌、肱三頭肌、背最長肌的骨骼肌，小塊分割后立即用液氮冷凍并密封保存?zhèn)溆谩?/p>

Trizol RNA抽提試劑 美國TaKaRa試劑公司；BioRT Two Step反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×real time PCR Master Mix熒光定量PCR試劑、核酸燃料 北京百泰克生物有限公司；異丙醇、氯仿、無水乙醇、焦炭酸二乙酯 北京

全式金生物技術(shù)有限公司；5×TBE緩沖液、6×上樣緩沖液溴酚蘭、DNA Maker 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ND-1000型微量紫外分光光度計(jì) 美國NanoDrop公司；GDS-8000凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

目的基因PPARγ上下游引物序列參考Huang等[14]的方法，目的基因FAS上下游序列參考張英杰等[15]的方法。內(nèi)參基因采用β-actin，其上下游引物序列參考吳瓊彪等[16]的方法。引物如表1所示。

表 1 PPARγ、FAS基因引物序列

1.3.2 RNA的提取

取一定肉樣在液氮中磨碎，約100 mg組織加入1mL裂解液。在25 ℃放置5 min，將其裂解細(xì)胞與溶劑混勻使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。之后將樣品4℃、12 000×g離心10 min，取上清液。上清液中加入0.2 mL氯仿，振蕩15s，室溫放置3 min。4 ℃、12 000×g離心15 min。待出現(xiàn)分層，分別為黃色有機(jī)相底層，無色水相上層以及中間層。小心提取含有RNA的水相轉(zhuǎn)移到新管中，用冰異丙醇沉淀水相中的RNA，每使用1 mL Trizol加入0.5 mL異丙醇，低溫放置10 min。4 ℃、12 000×g離心10 min，將上清液移去。75%乙醇洗滌RNA沉淀，每使用1 mL Trizol至少加1 mL 75%乙醇。4 ℃、7 500×g離心5 min，棄上清液。室溫放置干燥RNA沉淀。再加25 μL無RNase水，輕搖RNA溶解。-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RNA濃度純度檢測

使用紫外分光光度計(jì)，用DEPC處理水校正零點(diǎn)，讀取RNA樣品OD260 nm/280 nm的比值及濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)所得到的Ct值用運(yùn)Excel軟件進(jìn)行計(jì)算其各自的表達(dá)量并用SAS軟件進(jìn)行顯著性和與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏珠穆沁肉羊不同月齡、不同骨骼肌部位PPARγ和FAS基因表達(dá)量

2.1.1 不同月齡、不同骨骼肌部位PPARγ基因表達(dá)

小寫字母不同，表示相同部位、不同月齡間差異顯著（P<0.05）；大寫字母不同，表示相同月齡、不同部位骨骼肌間差異顯著（P<0.05）。下同。

圖 1 肉羊不同月齡不同骨骼肌部位PPARγ基因表達(dá)量

Fig.1 Relative expression levels of PPARγ gene in different muscles at different months of age

由圖1可知，同一部位骨骼肌不同月齡之間的對(duì)比可以得出：對(duì)于背最長肌，肉羊PPARγ表達(dá)量1月齡和3月齡之間無顯著差異；6月齡相對(duì)于3月齡其表達(dá)量顯著提高（P<0.05）；而9月齡的表達(dá)量最低，12月齡的表達(dá)量最高，均與1、3、6、9、18月齡間存在顯著差異

（P<0.05）；18月齡表達(dá)量與1月齡和6月齡表達(dá)量無顯著差異，但比3月齡顯著較高（P<0.05）。

對(duì)于股二頭肌，肉羊1月齡PPARγ的表達(dá)量最高，與3、6、9、12、18月齡間存在顯著差異（P<0.05）；3月齡和6月齡PPARγ的表達(dá)量沒有顯著差異，且均顯著高于9月齡PPARγ的表達(dá)量；12月齡PPARγ的表達(dá)量顯著高于3、6、9、18月齡的表達(dá)量（P<0.05）；18月齡PPARγ的表達(dá)量與9月齡沒有顯著差異，均顯著低于1、3、6、12月齡的表達(dá)量（P<0.05）。

對(duì)于肱三頭肌，1月齡PPARγ的表達(dá)量高于6月齡，但無顯著性差異，1月齡PPARγ的表達(dá)量顯著高于3月齡

（P<0.05）；3、6、9月齡PPARγ的表達(dá)量沒有顯著差異；12月齡PPARγ的表達(dá)量顯著高于1、3、6、9、18月齡（P<0.05）；18月齡PPARγ的表達(dá)量其顯著低于1、3、6、9、12月齡（P<0.05）。

同一個(gè)月齡段不同骨骼肌部位之間的對(duì)比可以得出：1月齡股二頭肌的PPARγ基因表達(dá)量最高、肱三頭肌次之、背最長肌最低，且3個(gè)部位間均存在顯著差異

（P<0.05），背最長肌的表達(dá)量顯著低于其他兩個(gè)部位（P<0.05）；3、6、9月齡背最長肌、股二頭肌間PPARγ的表達(dá)量沒有顯著性差異，肱三頭肌的表達(dá)量顯著高于背最長肌和股二頭肌兩個(gè)部位（P<0.05）；12月齡肱三頭肌PPARγ的表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)部位（P<0.05），背最長肌的表達(dá)量顯著高于股二頭肌

（P<0.05）。18月齡背最長肌和肱三頭肌表達(dá)量沒有顯著差異，均顯著高于股二頭肌表達(dá)量（P<0.05）。

2.1.2 不同月齡、不同骨骼肌部位FAS基因表達(dá)量

圖 2 肉羊不同月齡不同骨骼肌部位FAS基因表達(dá)量

Fig.2 Relative expression levels of FAS gene in different muscles at different months of age

由圖2可知，同一部位骨骼肌不同月齡之間的對(duì)比可以得出：對(duì)于肉羊背最長肌，3月齡、6月齡和12月齡之間FAS基因表達(dá)量無顯著差異，但1月齡、9月齡、12月齡之間差異顯著（P<0.05）。1月齡FAS的表達(dá)量極顯著低于3月齡和6月齡（（P<0.05），3月齡表達(dá)量顯著高于9月齡，6月齡與9月齡之間無顯著差異。1月齡與9月齡表達(dá)量無顯著差異，9月齡表達(dá)量顯著低于12月齡（P<0.05），18月齡相比于12月齡，表達(dá)量顯著低

（P<0.05）。

對(duì)于股二頭肌，1月齡FAS的表達(dá)量顯著低于3月齡（P<0.05），3月齡的表達(dá)量最高，與1、6、9、12、18月齡間均具有顯著差異（P<0.05）；6月齡FAS的表達(dá)量稍低于9月齡FAS的表達(dá)量，而無顯著差異；9月齡FAS的表達(dá)量低于12月齡FAS的表達(dá)量，但無顯著差異；12月齡FAS的表達(dá)量顯著高于18月齡FAS的表達(dá)量（P<0.05）。

對(duì)于肱三頭肌，1月齡FAS的表達(dá)量顯著低于3月齡FAS的表達(dá)量（P<0.05），3月齡FAS的表達(dá)量相對(duì)高于6月齡FAS的表達(dá)量，但無顯著差異，6月齡FAS的表達(dá)量高于9月齡FAS的表達(dá)量，但無顯著差異，9月齡FAS的表達(dá)量顯著低于12月齡FAS的表達(dá)量（P<0.05），18月齡FAS的表達(dá)量顯著低于1、3、6、9和12月齡FAS的表達(dá)量（P<0.05）。

同一個(gè)月齡段不同骨骼肌部位之間的對(duì)比可以得出：1、3、6、9、12月齡時(shí)肉羊的肱三頭肌FAS的表達(dá)量最高，股二頭肌FAS的表達(dá)量次之，背最長肌FAS的表達(dá)量最低，而且互相之間均存在顯著差異（P<0.05）；18月齡背最長肌FAS的表達(dá)量最高、股二頭肌FAS的表達(dá)量次之、肱三頭肌FAS的表達(dá)量最低，且均存在顯著差異（P<0.05）。

2.2 烏珠穆沁肉羊肌內(nèi)脂肪含量與PPARγ、FAS基因表達(dá)量及相關(guān)性分析

2.2.1 肌內(nèi)脂肪含量與PPARγ、FAS基因表達(dá)量

表 2 肉羊不同月齡不同骨骼肌部位肌內(nèi)脂肪含量與PPARγ、FAS基因表達(dá)量

由表2可知，PPARγ基因在9月齡和18月齡時(shí)表達(dá)相對(duì)較低，在12月齡時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最高水平。FAS基因3月齡和12月齡表達(dá)量較高，18月齡表達(dá)量較低。2個(gè)基因的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量的趨勢正好相反，即與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)。

2.2.2 肌內(nèi)脂肪含量與與PPARγ、FAS基因表達(dá)量相關(guān)性分析

由表3可知，在背最長肌部位上，PPARγ基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量之間呈負(fù)相關(guān)；在股二頭肌上，其PPARγ基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量之間呈負(fù)相關(guān)；在肱三頭肌上，其PPARγ基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量之間呈負(fù)相關(guān)。在背最長肌部位上，其FAS基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量之間呈負(fù)相關(guān)；在股二頭肌部位上，其FAS基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量之間呈負(fù)相關(guān)；肱三頭肌部位上，其FAS基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量之間的相關(guān)系數(shù)R為-0.980，在極顯著水平上呈負(fù)相關(guān)。

表 3 肌內(nèi)脂肪含量與PPARγ、FAS基因表達(dá)量相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 自然放牧條件下肉羊不同月齡，不同部位骨骼肌PPARγ基因與肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性

肉羊在自然放牧的條件下PPARγ基因表達(dá)量隨月齡的變化在背最長肌、股二頭肌和肱三頭肌3個(gè)部位上的均有相同趨勢。在9月齡和18月齡時(shí)表達(dá)量相對(duì)較低，而12月齡時(shí)達(dá)到最高水平。肉羊1月齡時(shí)，PPARγ基因表達(dá)量相對(duì)較高，其主要原因有可能是肉羊剛出生PPARγ基因要參與脂肪細(xì)胞的形成。3月齡時(shí)的肉羊通過運(yùn)動(dòng)、骨骼肌生長等原因，與1月齡相比較其PPARγ基因表達(dá)量變化較小。當(dāng)肉羊6月齡時(shí)正值夏季，草原上牧草生長茂盛，PPARγ基因表達(dá)增加會(huì)使肌內(nèi)脂肪增加。9月齡時(shí)牧草旺盛，肉羊肌內(nèi)脂肪達(dá)到較高水平，因牧草旺盛機(jī)體本身具有較高的脂肪含量，而自身PPARγ基因表達(dá)量會(huì)降低并且不會(huì)過多表達(dá)使肌內(nèi)脂肪沉積。12月齡的肉羊正處于冬季，因冬天牧草枯黃稀少，自身需要分化前脂肪細(xì)胞為脂肪細(xì)胞，因而PPARγ基因表達(dá)水平較高，使肌內(nèi)脂肪含量保持在較低水平。18月齡時(shí)的肉羊又處于夏季，牧草旺盛，PPARγ基因表達(dá)量較低，原因可能是機(jī)體需要蓄積脂肪。因此，自然放牧的肉羊的PPARγ基因表達(dá)量以及肌內(nèi)脂肪含量可能與牧草之間有很大的相關(guān)性。

在肉羊生長各個(gè)階段，肌內(nèi)脂肪含量與PPARγ基因表達(dá)量之間的相關(guān)性分析可知，背最長肌、股二頭肌和肱三頭肌部位上均存在負(fù)相關(guān)。這可能與PPARγ基因自身表達(dá)調(diào)控和本身脂肪豐富有一定的作用。有研究報(bào)道蒙古羊90～160日齡期間PPARγ基因與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)系數(shù)為-0.884 9（P=0.1084）[17]。Huang等[14]研究發(fā)現(xiàn)在哈薩克羊中PPARγ基因在2～90日齡間的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為-0.835（P<0.01）。郝稱莉等[18]研究發(fā)現(xiàn)背最長肌PPARγ基因的表達(dá)量在4～12 月齡期間與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.441（P=0.076），腰大肌PPARγ基因的表達(dá)量在2～12月齡期間與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.120，股二頭肌PPARγ基因的表達(dá)量在5～6月齡期間與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.301。本實(shí)驗(yàn)中PPARγ基因與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)性支持以上研究結(jié)果。

3.2 自然放牧條件下肉羊不同月齡不同部位骨骼肌FAS基因與肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性

自然放牧飼養(yǎng)條件下肉羊FAS基因隨月齡變化的表達(dá)量為1月齡時(shí)背最長肌、股二頭肌和肱三頭肌部位上FAS基因表達(dá)量都在較低水平上。3月齡時(shí)肉羊FAS基因表達(dá)量升高，6月齡時(shí)肉羊FAS基因表達(dá)量在股二頭肌部位上顯著降低。

肉羊FAS基因表達(dá)量在1月齡時(shí)較低，原因可能是剛出生時(shí)主要以PPARγ等基因來調(diào)控脂肪細(xì)胞的形成。3月齡和12月齡的肉羊FAS基因表達(dá)量與1、6、9、18月齡時(shí)相比均偏高，而3月齡和12月齡的肉羊肌內(nèi)脂肪含量均偏低，此原因可能與季節(jié)環(huán)境因素有關(guān)。又因3月齡和12月齡時(shí)冬季牧草缺少，肉羊機(jī)體需自身將葡萄糖等能量轉(zhuǎn)變?yōu)橹?，此過程中的最后一步合成脂肪酸時(shí)會(huì)需要FAS，因此機(jī)體本身的FAS基因表達(dá)量會(huì)增加，所以3月齡和12月齡時(shí)FAS基因表達(dá)量較高。9月齡和18月齡時(shí)牧草旺盛，機(jī)體自身的脂肪含量較多，所以肉羊FAS基因表達(dá)量較低。而6月齡的表達(dá)量與3月齡的表達(dá)量相比較低，可能與采食到的牧草量的增加有關(guān)。因此FAS基因表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)關(guān)系為負(fù)相關(guān)。姚焰礎(chǔ)[19]認(rèn)為10～40 kg蘇尼特羔羊肌內(nèi)FAS基因持續(xù)表達(dá)，其表達(dá)量隨體質(zhì)量增加而下降，30 kg和40 kg時(shí)的表達(dá)量顯著低于10 kg和20 kg（P<0.05），與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

因此，自然放牧條件下肉羊的脂肪沉積和相關(guān)基因（PPARγ和FAS基因）的表達(dá)跟肉羊的生長（骨骼肌發(fā)達(dá)）、牧草以及飼養(yǎng)環(huán)境條件有著密切的關(guān)聯(lián)性。

4 結(jié) 論

自然放牧條件下，肉羊與肌內(nèi)脂肪相關(guān)的PPARγ和FAS基因表達(dá)量會(huì)隨著月齡的增加、季節(jié)的變化而變化。肉羊PPARγ基因隨著月齡增加的表達(dá)量為1月齡（剛出生）和12月齡（牧草枯竭）時(shí)表達(dá)較高，9月齡和18月齡（牧草旺盛）時(shí)表達(dá)較低。PPARγ和FAS基因相對(duì)表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈負(fù)相關(guān)。

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