王平 賀海生

近幾年來(lái)，隨著生化分析和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，作物種子純度檢驗(yàn)方法已由外觀形態(tài)發(fā)展到生理生化水平和分子水平上的鑒定。

一、蛋白質(zhì)電泳技術(shù)檢驗(yàn)法

是指利用電泳技術(shù)對(duì)備檢樣品的種子或幼苗的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、染色，形成蛋白質(zhì)電泳譜帶的差異，并與標(biāo)準(zhǔn)品種相比較，從而鑒定品種的真實(shí)性和純度的一種方法。不同作物品種，基因不同，基因的直接表達(dá)產(chǎn)物---蛋白質(zhì)在種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)等方面亦不同。該法即是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性來(lái)反映不同品種DNA組成上的差異，從而進(jìn)行品種鑒定。該法快速、可靠，不受環(huán)境影響。

1.種子貯藏蛋白電泳法種子中所含的貯藏蛋白質(zhì)可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等。每一類蛋白質(zhì)的比例因物種而異，但在品種鑒定上多是根據(jù)醇溶蛋白（禾谷類）和球蛋白 （豆類）的多樣性。不同蛋白質(zhì)所帶電荷不同，在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度也不同，電泳之后，通過(guò)染色顯示蛋白質(zhì)條帶的數(shù)目、位置和顏色深淺，便構(gòu)成品種的"指紋" 特征，可用于品種鑒定。所用電泳技術(shù)包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、淀粉膠電泳及等電聚焦電泳等。另外，蛋白質(zhì)電泳圖譜易受種子（或幼苗）發(fā)育階段及表達(dá)器官的影響，有時(shí)不夠穩(wěn)定，影響了圖譜分析，從而影響了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.同工酶電泳法同工酶是指來(lái)源相同，催化相同反應(yīng)而結(jié)構(gòu)不同的酶分子類型，具組織、發(fā)育和品種間特異性。該法是指利用電泳技術(shù)（包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、淀粉膠電泳等） 來(lái)分離各種酶的同工酶，通過(guò)比較同工酶譜，來(lái)確定作物種子的純度。目前，在作物種子純度鑒定中，最常用的、多態(tài)性較強(qiáng)的是脂酶和過(guò)氧化物酶，所用方法多為聚丙烯酰胺凝膠電泳法。

2.1同工酶具組織、發(fā)育的特異性：不同組織、不同發(fā)育時(shí)期，同工酶的數(shù)量和組成不同。利用同工酶鑒定種子純度所用材料多為幼苗，而將種子萌發(fā)為幼苗不光費(fèi)時(shí)，還往往因?yàn)榉N子在萌發(fā)進(jìn)程上的不一致而導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果偏差較大。

2.2因酶易失活，故技術(shù)上有一定難度。

2.3譜帶位點(diǎn)與凝膠濃度、提取液配方、電泳程序等有關(guān)。

二、形態(tài)撿驗(yàn)法

形態(tài)學(xué)方法是檢驗(yàn)人員借助放大鏡、解剖鏡等工具，依據(jù)某一作物品種不同于其他品種的特定的外觀形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行鑒定的方法。

1.田間小區(qū)種植檢驗(yàn)法（成株期形態(tài)檢驗(yàn)法）該法是將一定量的作物種子在田間種植一個(gè)小區(qū)，單粒播種，不間苗，不定苗，并設(shè)有標(biāo)準(zhǔn)品種小區(qū)作對(duì)照，成株期依據(jù)其主要特征鑒定純度，這是最為通用的且比較可靠的方法。主要根據(jù)株形、株高、葉片數(shù)、葉色、葉片寬窄、花藥顏色等作出評(píng)判。但此法所需時(shí)間較長(zhǎng)，當(dāng)年所生產(chǎn)的種子要等下一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)或異地鑒定才能得到結(jié)果，往往喪失商機(jī)，且費(fèi)工占地。而且這種方法受環(huán)境影響頗大，使得鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性受到一定程度的影響。

2.種子形態(tài)檢驗(yàn)法根據(jù)種子形狀、大小、色澤、質(zhì)地、表面的光與毛以及種子外表各部位的特征來(lái)加以鑒別，以區(qū)分本品種與異品種。該法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速，但準(zhǔn)確性較差，且隨著現(xiàn)代育種科學(xué)的發(fā)展，不同品種間種子外觀形態(tài)的差異越來(lái)越小，因此靠區(qū)別種子形態(tài)上的差異來(lái)鑒定種子純度也變得越來(lái)越困難。

3.種苗形態(tài)檢驗(yàn)法 該法根據(jù)不同品種幼苗的獨(dú)特性狀進(jìn)行檢驗(yàn)，如幼苗芽鞘顏色、幼苗生長(zhǎng)錐、子葉的形狀、顏色、大小等。該法簡(jiǎn)便、省時(shí)，但受環(huán)境的影響頗大，檢驗(yàn)結(jié)果不夠可靠。由于形態(tài)學(xué)方法的諸多不足，用一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、實(shí)用的室內(nèi)檢測(cè)方法來(lái)代替形態(tài)法已成必然。將電泳技術(shù)和DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到純度鑒定這一領(lǐng)域，恰恰順應(yīng)了這一要求。

三、DNA分子標(biāo)記技術(shù)檢驗(yàn)法

品種間形態(tài)和生化上的區(qū)別，歸根到底是品種間在基因（DNA）上的區(qū)別。DNA分子標(biāo)記技術(shù)即是通過(guò)對(duì)品種DNA的多態(tài)性即DNA堿基序列的差異進(jìn)行分析，從而鑒別不同品種。其檢測(cè)對(duì)象是種子的DNA片段（基因），沒(méi)有器官的特異性，不受環(huán)境的影響，有較高的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。

四、結(jié)語(yǔ)

作物種子純度檢驗(yàn)技術(shù)已由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法發(fā)展到分子水平，其方法是由簡(jiǎn)單到復(fù)雜，結(jié)果也更加精確。每一種方法都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，至今還沒(méi)有哪一種方法能夠比較準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行種子純度檢驗(yàn)。與其他方法相比，DNA分子標(biāo)記技術(shù)多態(tài)性豐富、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、無(wú)器官發(fā)育時(shí)期的特異性，不受環(huán)境影響，但所需儀器精密、藥品昂貴，程序復(fù)雜，離普及和應(yīng)用尚有距離。因此，在進(jìn)行具體的種子純度檢測(cè)時(shí)，應(yīng)視具體情況靈活掌握，將傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法、現(xiàn)代生化方法和分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，充分發(fā)揮綜合技術(shù)優(yōu)勢(shì)，方能達(dá)到準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、快速檢測(cè)的目的。

（作者單位：156300北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司建三江分公司、黑龍江省農(nóng)墾總局建三江科學(xué)研究所）