徐石勇　李歐靜　張舒瑋　鄧慧　劉征輝　王永　蘭青闊

摘 要：以金銀花及其常見變種為材料，利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建分子指紋圖譜，并用于遺傳多樣性分析。選擇25個(gè)SSR位點(diǎn)用于多態(tài)性分析，其中3個(gè)位點(diǎn)具有較強(qiáng)多態(tài)性，并構(gòu)建基于Excel格式的金銀花SSR指紋圖譜，包括3對(duì)引物在6個(gè)供試材料中擴(kuò)增到的18條多態(tài)性條帶信息。應(yīng)用該指紋圖譜對(duì)金銀花及其變種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，金銀花與山銀花之間遺傳距離較遠(yuǎn)，僅0.28。應(yīng)用該指紋圖譜對(duì)87個(gè)市售金銀花進(jìn)行分析，能夠區(qū)分出河北、山東、河南等地的金銀花品種。SSR標(biāo)記技術(shù)具有快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，具備金銀花種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化分析及中藥材市場(chǎng)化檢測(cè)應(yīng)用的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：金銀花；SSR標(biāo)記；指紋圖譜；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：Q946 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.003

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效，為常用大宗中藥材?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明金銀花中含有木犀草黃素、肌醇、皂甙、綠原酸，糖類、蛋白質(zhì)、維生素、多種化合物及多種微量元素，一些常用藥如銀翹解毒丸、清開靈、銀黃片等均以金銀花為主要原料。隨著我國對(duì)金銀花開發(fā)利用的突破性進(jìn)展，其在茶飲、日化、化妝品和保健品等領(lǐng)域的需求急劇增大。為滿足市場(chǎng)需求，我國近年來大面積種植金銀花藥材，但在種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析方面還沒有一套標(biāo)準(zhǔn)化的方法。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)（一般為1～5個(gè)）核苷酸為重復(fù)單位組成的核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、共顯性、分布廣等優(yōu)點(diǎn)，常用于蔬菜遺傳育種[1]、基因定位[2]、遺傳圖譜構(gòu)建[3]、種質(zhì)鑒定等。玉米[4]、小麥[5]、棉花[6]等主要農(nóng)作物已建立成熟的基于SSR標(biāo)記的種子鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及配套的指紋圖譜。本研究以金銀花及其常見變種為材料，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)建立指紋圖譜，并對(duì)河北、山東、河南金銀花樣品的遺傳多樣性進(jìn)行分析，為促進(jìn)金銀花藥材鑒定標(biāo)準(zhǔn)化與品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、金銀花、金銀花4倍體等標(biāo)準(zhǔn)品（依次編號(hào)為S1～S6，表1），以及購自山東、河南的87個(gè)市售金銀花樣品，由天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司提供，研磨后用于DNA提取。

1.2 基因組DNA提取

參照Murray&Thompson[7]方法，做適當(dāng)改良后用于金銀花基因組DNA提取。DNA濃度用NanoDrop-1000 spectrophotometer（Thermo）檢測(cè)并稀釋至50 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR位點(diǎn)信息與引物

從GenBank數(shù)據(jù)庫查詢金銀花核酸序列369條，使用BatchPrimer3在線軟件掃描分[8]獲得32個(gè)候選SSR位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)SSR-PCR引物。并結(jié)合文獻(xiàn)查閱，確定25對(duì)引物（表2）用于多態(tài)性分析。

1.4 SSR-PCR分析

PCR反應(yīng)采用10 μL體系：其中2×GoTaq Green Master Mix（Promega）5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，DNA模板0.5 μL（50 ng·μL-1），滅菌去離子水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)反應(yīng)（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72℃ 30 s）；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR儀為ABI veriti 96 well Thermol cycler。聚丙烯酰胺凝電泳：膠濃度為8%，電壓250 V，電泳1 h；采用銀染法進(jìn)行顯色。

1.5 數(shù)據(jù)分析

凝膠顯色后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照，使用GeneTools（Sygene）軟件對(duì)電泳圖譜中穩(wěn)定且易分辨的條帶進(jìn)行分子量分析；聚類分析使用SLT-NTSYS（2.10）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花SSR位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

以6份材料DNA為模板，對(duì)25對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25對(duì)引物中4對(duì)無擴(kuò)增條帶，有13對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶大于1條，說明該13個(gè)SSR位點(diǎn)在6個(gè)材料中具有多態(tài)性。其中位點(diǎn)jp.ssr48、jp.ssr58和jp.ssr59多態(tài)性較高（圖1），適合于金銀花SSR分子指紋圖譜的構(gòu)建。

2.2 金銀花SSR指紋圖譜構(gòu)建

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，比較3個(gè)SSR位點(diǎn)在6份材料中的多態(tài)性。將每個(gè)樣品的特異性譜帶按照相互位置差異在相同遷移率位置上進(jìn)行“1，0”標(biāo)注，構(gòu)建基于Excel格式的SSR指紋圖譜[9]。SSR指紋圖譜包含了6個(gè)材料3個(gè)SSR位點(diǎn)信息，共18個(gè)條帶，平均每對(duì)引物 6條（表3）。

2.3 金銀花SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析與應(yīng)用

對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明6個(gè)材料分為2大類（圖2），大毛花及其4倍體為一類，灰氈毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、黃褐毛忍冬為另一類，山銀花與金銀花遺傳距離較遠(yuǎn)，僅0.28。山銀花中灰氈毛忍冬、華南忍冬遺傳距離最近，其次為紅腺忍冬，再次為黃褐毛忍冬。

使用上述3對(duì)SSR引物，對(duì)購自河北省巨鹿縣、山東省平邑縣、河南省封丘縣的87個(gè)金銀花樣品進(jìn)行PCR-SSR檢測(cè)及聚類分析。結(jié)果表明，三產(chǎn)地的樣品與山銀花的遺傳距離較遠(yuǎn)，全部為金銀花樣品；但又可分為兩類，其中一類為來自河北省巨鹿縣的50個(gè)樣品和來自河南省封丘縣的6個(gè)樣品，其一致性很強(qiáng)，表明兩地金銀花品種的親緣關(guān)系很近；來自山東省平邑縣的8個(gè)樣品被歸于另一類，但又細(xì)分為5小類。

3 結(jié)論與討論

來源純正、品質(zhì)優(yōu)良的藥用植物資源是中藥現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的重要前提。金銀花是我國常用大宗中藥材，亟需對(duì)其開展遺傳多樣性分析并建立標(biāo)準(zhǔn)化的種質(zhì)資源鑒定方法。自2007年以來，我國科學(xué)家應(yīng)用RAPD[10]、RFLP[11-12]、同工酶[13]、ISSR[14-15]、DNA Barcoding[16]等標(biāo)記技術(shù)對(duì)金銀花及其變種進(jìn)行遺傳多樣性分析，取得了顯著的效果。但上述標(biāo)記技術(shù)也存在著重現(xiàn)性差、樣品用量大、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜等缺陷，未能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。SSR標(biāo)記具有鑒別力高、開發(fā)成本低、操作相對(duì)自動(dòng)化、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，被普遍認(rèn)為是最接近于理想化的品種鑒定技術(shù)[17-20]。隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過網(wǎng)絡(luò)可以免費(fèi)獲得海量的EST等序列信息及具有SSR掃描及引物設(shè)計(jì)功能的生物軟件，這為EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)提供經(jīng)濟(jì)、便利的條件。

蔣超等[21]對(duì)忍冬及其變種紅白忍冬的EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步了解其SSR多態(tài)性特點(diǎn)，并通過試驗(yàn)證明了SSR標(biāo)記可用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。本研究通過對(duì)2種金銀花及其4種山銀花偽品進(jìn)行SSR標(biāo)記位點(diǎn)探索開發(fā)，構(gòu)建小規(guī)模的指紋圖譜，并初步應(yīng)用于金銀花種植資源遺傳多樣性分析及種質(zhì)鑒定分析。結(jié)果表明，SSR標(biāo)記技術(shù)具有快速、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，具備金銀花種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化分析及中藥材市場(chǎng)化檢測(cè)應(yīng)用的價(jià)值。但本研究存在樣本基數(shù)小、篩選位點(diǎn)少等問題，需要進(jìn)一步從全國范圍內(nèi)擴(kuò)大種質(zhì)資源的搜集，開展大規(guī)模的EST-SSR位點(diǎn)篩選。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王笑一，于拴倉，張鳳蘭，等.小白菜品種的SSR指紋圖譜及遺傳特異性分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（5）：97-103.

[2] 張海英，王振國，毛愛軍，等.與黃瓜白粉病抗病基因緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（6）：77-80.

[3] 金鳳媚，薛俊，夏時(shí)云，等.SSR標(biāo)記技術(shù)在番茄遺傳育種上的應(yīng)用[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué).2004，10（4）：13-17.

[4] Gadaleta A，Mangini G，Mulè G，et al.Characterization of dinucleotide and trinucleotide EST-derived microsatellites in the wheat genome[J].Euphytica，2007，153：73-85.

[5] 王鳳格，趙久然，郭景倫，等.中國玉米新品種標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋庫構(gòu)建研究的幾點(diǎn)思考[J].植物學(xué)通報(bào)，2005，22（1）：121-128.

[6] 韓宗福，王景會(huì)，申貴芳，等.黃河流域棉花主要品種SSR指紋圖譜構(gòu)建及遺傳差異分析棉花學(xué)報(bào)[J].棉花學(xué)報(bào)，2011，23（6）：545-551.

[7] Murray M，Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acid Res，1980（8）：4 321-4 325.

[8] Frank M Y，Naxin H，Yong Q G，et al.BatchPrimer3：a high throughput web application for PCR and sequencing primer designing[J].BMC Bioinformatics，2008（9）：253.

[9] 張飛，王煒勇，張智，等.光萼荷屬植物SSR反應(yīng)體系確立與指紋圖譜構(gòu)建[J].植物研究，2012，32（1）：115-119.

[10] 楊飛，張敏，彭興揚(yáng)，等.金銀花五個(gè)品系的RAPD分析及DNA指紋圖譜的建立[J].武漢植物學(xué)研究，2007，25（3）：235-238.

[11] Peng X，Li W，Wang W，et al. Identification of Lonicera japonica by PCR-RFLP and allele-specific diagnostic PCR based on sequences of internal transcribed spacer regions[J].Planta Med，2010，76（5）497-499.

[12] Wang C Z，Li P，Ding J Y，et al.Discrimination of Lonicera japonica Thunb. from different geographical origins using restriction fragment length polymorphism analysis[J].Biol Pharm Bull，2007，30：779-782.

[13] 趙永亮，張長(zhǎng)付，覃曉娟.金銀花的過氧化物酶和淀粉酶同工酶遺傳多樣性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（15）：6 225-6 227.

[14] 王曉明，謝碧霞，李俊彬，等.金銀花ISSR分子標(biāo)記及遺傳多樣性分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（6）：14-18.

[15] 董桂靈，胡尚欽，陳曉敏，等.不同金銀花種質(zhì)資源ISSR遺傳多樣性研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，46（6）：1 833.

[16] Sun Z，Gao T，Yao H，et al.Identification of Lonicera japonica and its related species using the DNA barcoding method [J].Planta Med，2011，77：301-306.

[17] Heckenberger M，Vander V J R，Melchinger A E，et al.Variation of DNA fingerprints among accessions within maize inbred lines and implications for identification of essentially derived varieties：II.Genetic and technical sources of variation in AFLP data and comparison with SSR data[J].Molecular Breeding，2003（12）：97-106.

[18] 陸光遠(yuǎn)，伍曉明，張冬曉，等.SSR標(biāo)記分析國家油菜區(qū)試品種的特異性和一致性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（1）：32-42.

[19] 劉冠明，鄭奕雄，陳建萍，等.珍珠豆型花生品種遺傳差異的SSR標(biāo)記分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（10）：28-31.

[20] 郝曉芬，王節(jié)之，王潞英，等.SSR標(biāo)記分析谷子遺傳多樣性[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（4）：45-48.

[21] 蔣超，袁媛，劉貴明，等.基于EST-SSR的金銀花分子鑒別方法研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（2）：803-810.