盧錦森，馬中飛，縱何香，葉桂萍，郭利梅，何舒寧，張夢琳，陳曉宇

◇藥學研究◇

白藜蘆醇對佐劑性關節(jié)炎大鼠血管內皮因子表達的影響

盧錦森1，馬中飛1，縱何香1，葉桂萍1，郭利梅1，何舒寧1，張夢琳1，陳曉宇2

目的探討白藜蘆醇（Res）對佐劑性關節(jié)炎（AA）模型大鼠關節(jié)滑膜組織的抗炎作用和對血管內皮生長因子（VEGF）表達水平的影響。方法60只SD大鼠隨機分正常組（10只）和模型組（50只），模型組左后足趾皮內注射弗氏完全佐劑建立AA模型，模型組在建模后12 d再分5組：模型對照組、Res低劑量組（5 mg／kg）、Res中劑量組（15 mg／kg）、Res高劑量組（30 mg／kg）、陽性藥塞來昔布組（5 mg／kg），給藥16 d后處死大鼠，對各組大鼠踝關節(jié)滑膜組織行病理切片、HE染色和VEGF免疫組化染色。觀察滑膜增生、血管翳形成、炎癥滲出、關節(jié)軟骨和骨破壞等情況。Western blot法檢測VEGF蛋白的表達情況。結果Res治療組的關節(jié)病理學評分明顯低于模型對照組，免疫組化染色以及Western blot結果顯示，Res能降低滑膜組織VEGF表達水平。結論Res有改善大鼠關節(jié)滑膜炎癥、抑制滑膜組織VEGF表達的作用，這可能與Res治療AA關節(jié)炎有關。

佐劑性關節(jié)炎；白藜蘆醇；血管內皮因子；大鼠

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的慢性、系統(tǒng)性的自身免疫性關節(jié)疾病，持久反復發(fā)作的滑膜炎導致關節(jié)內軟骨和骨的破壞，關節(jié)功能障礙，甚至殘廢［1］。大鼠佐劑性關節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型是一種RA免疫性炎癥模型，RA和AA存在許多類似之處，且造模方法簡單易行，是目前較常用的RA動物模型，為理想的篩選和研究治療RA藥物的模型［2］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種特異性的作用于血管內皮細胞的生長因子，能促進血管生成［3］。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是存在于葡萄、虎杖、決明、藜蘆等的非黃酮類多酚化合物，具有抗脂質過氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調節(jié)等多種生物學功效［4］。該課題組前期研究［5－6］表明，Res對AA模型大鼠有一定的治療作用，但其機制有待進一步闡明，該研究進一步觀察Res對AA模型大鼠的治療作用，探究這種治療作用是否與抑制滑膜組織VEGF有關。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑足跖容積測量儀YLS-TA購自山東醫(yī)學科學院；Res（溶于無菌0.5%羧甲基纖維素鈉中）、弗氏完全佐劑（freund′s complete adjuvant，F(xiàn)CA）購自美國Sigma公司；兔抗大鼠單克隆VEGF一抗購自美國Santa Cruz公司；免疫組化二抗、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司；BCA蛋白測定、ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Amersham Life Sciences公司。

1.2 實驗動物分組及給藥健康SD大鼠60只，雄性，體重200～210 g，安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。大鼠自由攝食飲水，飼養(yǎng)于室溫（25±2）℃。隨機將SD大鼠分為兩組：正常組（10只）、模型組（50只）。模型組于每鼠左后足趾皮內注射0.1 ml FCA致炎。于致炎第12天，模型組隨機均分為5組：模型對照組、Res低、中、高劑量（5、15、30 mg／kg）組、陽性藥塞來昔布組（5 mg／kg），每4 d稱重1次并根據(jù)體重調整用藥劑量，連續(xù)灌胃給藥16 d，正常組及模型對照組給予等劑量溶媒的0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.3 關節(jié)炎評分參照先前建立的方法［3］，自AA模型大鼠致炎后12天，每4 d測定一次關節(jié)炎指數(shù)評分，觀察大鼠多發(fā)性關節(jié)炎病變的嚴重程度。每爪評分標準如下，0分：正常；1分：踝關節(jié)紅斑和輕微腫脹；2分：踝關節(jié)或掌關節(jié)紅斑和輕微腫脹；3分：踝關節(jié)或掌關節(jié)紅斑和中度腫脹；4分：踝關節(jié)重度腫脹，最大評分12分。大鼠非致炎側右踝關節(jié)以下的容積變化的繼發(fā)性炎癥采用排水法測定，腫脹度（Δml）＝致炎后容積－致炎前容積。于致炎起第28天處死所有大鼠，每組大鼠中隨機選擇4只大鼠，用手術器械截斷四肢、剝皮并將其用石蠟包埋以備后續(xù)形態(tài)學相關檢查，每組剩余6只大鼠迅速取踝關節(jié)滑膜組織，與液氮罐中冷藏，以備后續(xù)相關蛋白檢測。

1.4 踝關節(jié)滑膜組織免疫組化和VEGF血管計數(shù)按照SP試劑盒操作說明書，4%多聚甲醛固定大鼠踝關節(jié)，脫鈣、脫水、石蠟包埋、厚5 μm連續(xù)切片，免疫組化SP法染色：3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，抗原微波加熱修復，5%羊血清封閉抗原10 min，滴加50 μl兔抗大鼠VEGF單克隆抗體（濃度1 ∶300），4℃孵育過夜，滴加50 μl生物素化羊抗兔IgG二抗工作液，37℃孵育30 min，現(xiàn)配DAB染液顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片，光鏡下觀察。PBS替代一抗為陰性對照，光鏡下組織切片呈棕黃色顆粒性沉積區(qū)域為陽性染色部位。參照文獻［5］計算陽性血管分數(shù)，200倍光鏡下，每張VEGF免疫組化切片隨機選取10個視野，計數(shù)每個視野的VEGF陽性血管平均光密度（average optical density，OD）值，兩位觀察者獨立進行測定，誤差小于5%的情況下，取平均值。

1.5 Western blot法測定VEGF蛋白的表達液氮中凍存的各組滑膜組織取樣，并將組織樣品于研缽中研磨成勻漿，按照試劑盒說明書配置細胞裂解液裂解研磨成勻漿的組織，按步驟離心提取蛋白。按BCA試劑盒說明書，測定每組樣品的總蛋白濃度，按照（樣品∶5×上樣緩沖液＝4∶1）的比例加入5×上樣緩沖液，100℃金屬浴10 min，保存于－20℃冰箱。每組取30 μg總蛋白，在12%SDSPAGE分離膠中電泳，并于350 mA橫流將蛋白轉至0.22 μm孔徑的PVDF膜上。用PBST洗滌PVDF膜，并用5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，按照目的蛋白和轉染內參所在位置剪開膜，目的蛋白部分加入用一抗稀釋液稀釋后的兔抗鼠VEGF（1∶2 000稀釋）10 ml于4℃搖床孵育過夜。轉染內參部分加入用一抗稀釋液稀釋后的兔抗鼠β-actin抗體（1∶4 000稀釋）10 ml于4℃搖床孵育過夜。次日用5%脫脂奶粉的PBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋）孵育2 h，洗滌后ECL化學發(fā)光法顯色，Image J灰度分析軟件作半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 15.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。計量資料經(jīng)過方差齊性檢驗后采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 Res對大鼠繼發(fā)炎癥的影響致炎后第12天模型組大鼠非致炎側足趾開始腫脹，呈繼發(fā)性病變，呈進行性加重右側和前足腫脹，逐漸行動不便，站立不穩(wěn)。與正常組大鼠比較，相應時間點的AA模型組大鼠右足較正常組多發(fā)性關節(jié)評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Res降低了AA模型大鼠多發(fā)性關節(jié)炎評分，Res高劑量、陽性藥塞來昔布治療組較Res小劑量組更為明顯，見圖1。

2.2 Res對AA模型大鼠繼發(fā)性足腫脹的影響與AA模型對照組比較，Res自用藥8 d后開始發(fā)揮療效，Res（5、15、30 mg／kg）和陽性藥塞來昔布可明顯抑制AA模型大鼠的繼發(fā)性足腫脹，以Res（30 mg／kg）組和塞來昔布（5 mg／kg）組作用更為明顯。見圖2。

2.3 免疫組織化學法檢測Res對AA模型大鼠踝關節(jié)的VEGF蛋白表達結果表明，在AA模型大鼠滑膜襯里層血管內皮VEGF呈高表達；而隨著Res治療濃度的增加，血管內皮細胞VEGF蛋白陽性反應漸減弱，提示Res可降低血管內皮VEGF的活性而改善AA模型大鼠的滑膜組織的血供。模型對照組大鼠OD值（0.38±0.12）明顯高于正常組（0.13±0.04），差異有統(tǒng)計學意義（t＝5.962，P＜0.01），與模型對照組比較，Res治療組（5、15、30 mg／kg）降低了VEGF陽性血管OD值（0.29±0.11 vs 0.25±0.09 vs 0.21±0.05），差異有統(tǒng)計學意義（t＝2.306、3.126、6.856，P＜0.05），即高劑量Res降低VEGF陽性血管OD值更為明顯。見圖3。

2.4 Res對關節(jié)滑膜組織中VEGF蛋白表達的影響與正常組比較，模型組關節(jié)滑膜組織中VEGF的表達明顯上調，而Res各劑量組滑膜組織中VEGF蛋白表達水平低于模型對照組，但仍高于正常組。與模型對照組比較，5、15、30 mg／kg Res組和陽性藥塞來昔布（5 mg／kg）組VEGF蛋白明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

血管增生是RA最先出現(xiàn)的病變之一，此時滑膜的微血管數(shù)量顯著增加，隨著大量細胞因子和炎性介質的釋放，以中性粒細胞為代表的各類炎細胞逐漸侵蝕滑膜深處，在血管生成因子的誘導下，滑膜的微血管得以大量生成［6］。不斷生長的血管和各類炎細胞、炎性介質不斷破壞關節(jié)滑膜組織，隨著浸潤深度的增加，病變逐漸累積軟骨和骨，縱橫交錯的血管和滑膜乃至軟骨相互穿插融合，形成滑膜血管翳，豐富的血管為炎性介質如白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α的廣泛釋放提供了通道和補給，這些炎性介質隨之造成嚴重的骨質破壞和重塑，造成關節(jié)的畸形和持續(xù)的疼痛。而縱觀整個過程，增多的血管為炎性介質的擴散和炎細胞的浸潤提供了便捷的通道，是造成病變的關鍵原因［7］。因此，能夠促進血管生成和增加血管通透性的VEGF在RA整個病理過程中起著重要作用。

AA模型是一種RA免疫性炎癥模型，該模型的原發(fā)性病變類似急性炎癥模型，繼發(fā)性炎癥表現(xiàn)為以多發(fā)性關節(jié)炎為特征性病變的全身遲發(fā)型超敏反應，隨著人們對RA和AA的深入研究，發(fā)現(xiàn)兩者存在許多類似之處：如滑膜增生、血管翳形成及軟骨和骨破壞。且由于造模方法簡單易行成為了常用的RA動物模型，是研究治療RA藥物的理想模型［2，8］。本課題組前期研究［9］表明，AA大鼠關節(jié)發(fā)生病變后，關節(jié)滑膜囊充血水腫，以中性粒細胞為主的炎細胞不斷向深處浸潤，血管擴張導致其通透性下降，大量血漿、細胞、細胞因子滲出，滑膜細胞分泌大量粘液素、纖維素，隨著病變時間的延長，在炎性介質的刺激下，軟骨和骨不斷被破壞、重塑，同時出現(xiàn)變性，滑膜細胞不斷增生造成滑膜肥厚。因此，滑膜組織炎細胞的浸潤在AA模型大鼠關節(jié)損傷中占重要地位。而滑膜血管通透性和數(shù)量的增加成為了炎細胞浸潤的組織學基礎。1990年，因美國哈佛大學Folkman博士提出的Folkman理論而使得VEGF備受關注，VEGF基因由8個外顯子和7個內含子組成，定位于染色體6p21.3，有著不同的亞型，其中VEGF121、VEGF165和VEGF189在人體內表達。不同的VEGF受體特異性地分布于血管內皮細胞，常見的有VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。當VEGF與其受體結合，能夠促進血管內皮細胞的分裂增生，增加血管的通透性，其活性也受到氧含量、細胞水平、基因水平的多重調控。在治療RA仍無理想手段的今天，尋找滑膜血管增生的抑制劑不失為一個具有美好前景的方向。找到阻抑VEGF的促血管生成作用的物質，就可以抑制炎性介質的釋放和浸潤，減少關節(jié)的破壞和重塑，抑制滑膜細胞的增生，從而有效治療RA。Res具有抗脂質過氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調節(jié)等多種生物學功效，由于VEGF能夠通過與特異性受體結合促進血管的生成，增強血管的通透性從而促進滑膜組織增生，破壞周圍軟骨和骨，本實驗推測Res可以通過下調VEGF來發(fā)揮治療RA作用［10］。

本實驗結果顯示，治療組大鼠原發(fā)側關節(jié)炎癥指數(shù)評分從第12～28天均一直明顯低于模型對照組，且Res（30 mg／kg）組比Res（5 mg／kg）組降低的程度更加明顯。同時，與模型對照組比較，治療組可明顯抑制AA模型大鼠的繼發(fā)性足腫脹，以Res（30 mg／kg）和陽性藥塞來昔布（5 mg／kg）治療組作用更為明顯。這說明Res對AA有明顯的治療作用，且有劑量依賴效應。Western blot顯示，Res治療組和陽性藥塞來昔布組滑膜組織中VEGF蛋白表達水平低于模型對照組；免疫組化結果也顯示同樣結果，在AA模型大鼠滑膜襯里層血管內皮VEGF蛋白呈高表達，隨著Res濃度的增加，血管內皮細胞VEGF蛋白陽性反應逐漸減弱。這說明Res可能通過抑制VEGF的表達和活性，從而發(fā)揮對AA的治療作用。

然而，Res是通過什么途徑來抑制VEGF的表達，在此途徑中又通過調控哪些物質進而影響VEGF的表達，都是值得思考的問題。Res可以通過下調促進血管新生的VEGF從而抑制血管翳形成，那么Res是否可以通過上調VEGF的拮抗因子從而下調VEGF以抑制血管新生來緩解AA癥狀，這些問題都有待進一步研究。

［1］ Chang Y，Wu Y，Wang D，et al.Therapeutic effects of TACI-Ig on rats with adjuvant-induced arthritis via attenuating inflammatory responses［J］.Rheumatology（Oxford），2011，50（5）：862－70.

［2］ Zuo J，Xia Y，Li X，et al.Therapeutic effects of dichloromethane fraction of Securidaca inappendiculata on adjuvant-induced arthritis in rat［J］.J Ethnopharmacol，2014，153（2）：352－8.

［3］ Wu X，Hou T，Luo F，et al.Vascular endothelial growth factor and physiological compressive loading synergistically promote bone formation of tissue-engineered bone［J］.Tissue Eng Part A，2013，19（21－22）：2486－94.

［4］ Xuzhu G，Komai-Koma M，Leung B P，et al.Resveratrol modulates murine collagen-induced arthritis by inhibiting Th17 and B-cell function［J］.Ann Rheum Dis，2012，71（1）：129－35.

［5］ Chen X Y，Wang Z C，Li J，et al.Regulation of synoviocyte activity by resveratrol in rats with adjuvant arthritis［J］.Exp Ther Med，2013，6（1）：172－6.

［6］ 安 梅，孫和炎，盧錦森，等.基質金屬蛋白酶-1及其抑制劑在白藜蘆醇治療佐劑性關節(jié)炎中的表達［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2014，49（6）：701－6.

［7］ 朱寶玉，田 靜，王奇緣，等.血管內皮細胞生長因子在骨關節(jié)炎患者膝關節(jié)滑膜和滑液中的表達及其意義［J］.中華風濕病學雜志，2011，15（9）：640－1.

［8］ Wang D，Hu S，Zhu J，et al.AngiotensinⅡtype 2 receptor correlates with therapeutic effects of losartan in rats with adjuvant-induced arthritis［J］.J Cell Mol Med，2013，17（12）：1577－87.

［9］ Sawaguchi Y，Hirata K，Suzuki R，et al.Suppression of murine collagen-induced arthritis by vaccination of synovial vascular endothelial cells［J］.Life Sci，2013，92（23）：1125－30.

［10］Bai Y J，Jiang D X，An N，et al.Effects of cold-damp and hotdamp environment on VEGF and IL-1 expression in joint cartilage cells in adjuvant arthritis in rats［J］.J Tradit Chin Med，2012，32 （2）：256－60.

Effect of resveratrol on expression of VEGF in rats with adjuvant arthritis

Lu Jinsen，Ma Zhongfei，Zong Hexiang，et al
（Dept of Clinical Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of anti-inflammatory and expression level of vascular endothelial growth factor（VEGF）of resveratrol（Res）on synovial tissues in rats with adjuvant arthritis（AA）.Methods60 SD rats were randomly divided into two groups：normal group（10 rats），model group（50 rats）.Model group was injected freund′s complete adjuvant induced arthritis，when the right paw was induced after 12 days and secondary immune-inflammatory feet were swollen，the model rats were randomly divided into 5 groups，and each group had 10 rats AA model，Res low dose group（5 mg／kg），Res middle dose group（15 mg／kg），Res high dose group（30 mg／kg），positive control celecoxib group（5 mg／kg）qd×16.After induced inflammatory paw，the expressions of VEGF in synovial tissue and articular cartilage was detected by immunohistochemistry，VEGF protein content in synovial tissue were detected by Western blot.ResultsRes could inhibit model group rats pathological damage，compared with the AA model group，synovial tissue expression of VEGF was significantly low in the resveratrol-treated groups and celecoxib group.ConclusionRes prevents the pathological changes of the joint degeneration，its mechanism may be invovled regulating the expression of VEGF in synovial tissue of AA rats.

adjuvant arthritis；resveratrol；vascular endothelial growth factor；rats

R-332

A

1000－1492（2015）07－0969－05

2015－04－08接收

國家自然科學基金（編號：81373421）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：201310366007）

安徽醫(yī)科大學1臨床醫(yī)學系、2組胚教研室，合肥 230032作者簡介：盧錦森，男，碩士研究生；

陳曉宇，男，博士，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：chenxy＠ahmu.edu.cn