傅寅佳， 楊 熹， 曹小年， 來森艷， 王桂華， 胡俊波， 李 襄△

論著

p53通過調(diào)控p55PIK抑制肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖＊

傅寅佳1， 楊 熹1， 曹小年2， 來森艷1， 王桂華1， 胡俊波1， 李 襄1△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1腫瘤研究所／胃腸外科2普胸外科，武漢 430030

目的 探討p55PIK對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響，及p55PIK上游可能的調(diào)控機(jī)制。方法 以肝癌SMMC-7721細(xì)胞為研究對(duì)象，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染p55PIK特異性小干擾RNA（siRNA）si-p55構(gòu)建p55PIK低表達(dá)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。通過CCK8檢測(cè)p55PIK對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p55PIK對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。轉(zhuǎn)染針對(duì)p53的小干擾RNA（siRNA）si-p53低表達(dá)p53，采用Western blot檢測(cè)p53對(duì)p55PIK表達(dá)的影響，并通過CCK8法檢測(cè)p53對(duì)p55PIK在肝癌細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用。結(jié)果 低表達(dá)p55PIK可導(dǎo)致肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力降低［轉(zhuǎn)染后96h，si-NC組、si-p55組的A值分別為（1.325±0.050）、（1.183±0.019）］，細(xì)胞周期G0／G1期阻滯［si-NC組:（39.07±2.02）%；si-p55組:（49.66±1.05）%］。低表達(dá)p53可在肝癌SMMC-7721細(xì)胞中上調(diào)p55PIK的表達(dá)。p55PIK可部分拮抗p53對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)論 p53可部分通過調(diào)控p55PIK抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖。

肝癌； p55PIK； p53； 細(xì)胞增殖

p55PIK是磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3-kinases，PI3Ks）的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基，有研究證實(shí)，其在乳腺癌、結(jié)腸癌中具有促進(jìn)腫瘤增殖與侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并在白血病細(xì)胞中具有抑制分化的作用［1－4］。目前發(fā)現(xiàn)，p55PIK可通過Rb、PCNA、NF-κB、TGF-β等經(jīng)典信號(hào)通路發(fā)揮下游效應(yīng)［5－7］。p55PIK作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)，是潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。然而，p55PIK在肝細(xì)胞癌中的生物學(xué)作用目前尚未見研究報(bào)道，且p55PIK上游的調(diào)控機(jī)制在國內(nèi)外也還未見詳細(xì)研究。

p53是最早被發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，在各類腫瘤中存在失活突變，在生物學(xué)功能上與細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡、DNA修復(fù)、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。近年來，有研究證實(shí)p53主要通過Rb、TGF-β、miR-34等下游通路發(fā)揮上述生物學(xué)功能［8－10］，然而p53在肝癌中的調(diào)控機(jī)制尚未完全明晰，進(jìn)一步完善p53信號(hào)通路理論將為新藥物的開發(fā)提供重要線索和依據(jù)。

由于p53在肝癌中存在廣泛的失活突變，且能通過調(diào)控一系列下游靶基因的表達(dá)而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。因此我們推測(cè)在肝癌中p55PIK的表達(dá)也可能受上游p53的調(diào)控。本研究以肝癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過經(jīng)典的分子生物學(xué)方法揭示并論證了上述假設(shè)，進(jìn)一步完善了p55PIK相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)理論。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購買于武漢博士德生物公司；CCK8購于武漢啟動(dòng)子生物公司；Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司；Opti-MEN、胎牛血清購于美國Gibco公司；p55PIK抗體、GAPDH抗體購于Santa Cruz公司；si-p53、si-p55及陰性對(duì)照序列si-NC由廣州瑞博公司合成與純化；BrdU購于BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞以含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液（HyClone），在恒溫37℃、5%CO2下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)SMMC-7721細(xì)胞生長至50%融合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以O(shè)pti-MEN分別稀釋Lipofectamine 2000和siRNA，室溫下靜置5min，將稀釋后的Lipofectamine 2000與siRNA輕柔混合，室溫下靜置20min。以上述混合物替換原有培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)6h后，換回常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.3 CKK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 常規(guī)消化收集轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，每孔種入約1× 104個(gè)細(xì)胞于96孔板中，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96h時(shí)，加入CCK8 10 μL／孔至待測(cè)組，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)2h，以酶標(biāo)儀檢測(cè)各組在450nm波長下的吸光度（A）值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.4 PI染色測(cè)定細(xì)胞周期 在轉(zhuǎn)染48h后，常規(guī)消化收集細(xì)胞，75%冰乙醇固定過夜，PBS洗滌，加入碘化丙啶（PI）（終濃度50μg／mL）和RNA酶A（終濃度50μg／mL），室溫下避光放置30min，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48h后，常規(guī)消化收集細(xì)胞，以RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白并測(cè)蛋白濃度（BCA法），以SDS-PAGE電泳分離蛋白，通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1h，4℃孵育一抗過夜，以TBST緩沖液漂洗后，在室溫下孵育二抗2h，再次洗膜后曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p55PIK對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

首先在SMMC-7721細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染針對(duì)p55PIK的特異性小干擾RNA（siRNA）si-p55或陰性對(duì)照序列si-NC，以驗(yàn)證si-p55的效果。在轉(zhuǎn)染48h后，通過Western blot檢測(cè)p55PIK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于si-NC組，si-p55組中p55PIK的蛋白表達(dá)有明顯降低（圖1），提示所用的si-p55可有效低表達(dá)p55PIK。隨后，在轉(zhuǎn)染后以CCK8法及PI染色法分別檢測(cè)細(xì)胞增殖能力與細(xì)胞周期進(jìn)程。CCK8法檢測(cè)顯示（圖2）:在轉(zhuǎn)染后72h及96h時(shí)，si-p55組平均A值分別為（0.663±0.025）、（1.183± 0.019），si-NC組分別為（0.731±0.215）、（1.325± 0.050）。自轉(zhuǎn)染后72h開始，si-p55組的A值均明顯小于對(duì)照si-NC組的A值（P＜0.01）。該結(jié)果提示，低表達(dá)p55PIK可抑制SMMC-7721的增殖。通過PI染色法對(duì)細(xì)胞周期分布檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖3）:si-p55組中G0／G1期細(xì)胞比例為（49.66± 1.05）%，S期為（40.85±1.08）%，G2－M期為（9.49 ±0.13）%，而在si-NC組中G0／G1期細(xì)胞比例為（39.07±2.02）%，S期為（51.78±1.71）%，G2－M期為（9.14±3.72）%，提示低表達(dá)p55PIK可致SMMC-7721細(xì)胞G0／G1阻滯。

圖1 si-p55減少SMMC-7721細(xì)胞中p55PIK的表達(dá)Fig.1 si-p55decreased the expression of p55PIK in SMMC-7721cells

圖2 p55PIK低表達(dá)抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖Fig.2 Knockdown of p55PIK inhibited the proliferation of SMMC-7721cells

圖3 p55PIK低表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞G0／G1期阻滯Fig.3 Knockdown of p55PIK led to cell cycle arrest in G0／G1phase

2.2 p53可調(diào)控p55PIK的蛋白表達(dá)

在SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染針對(duì)p53的siRNA si-p53，并以si-NC作為對(duì)照，通過Western blot檢測(cè)p53及p55PIK的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于si-NC組，si-p53組中p53蛋白表達(dá)明顯降低，同時(shí)p55PIK的蛋白表達(dá)明顯增高（圖4）。此結(jié)果提示，si-p53可有效抑制p53在SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)，且p53低表達(dá)可促進(jìn)p55PIK的蛋白表達(dá)。由此證明了p53在肝癌細(xì)胞中對(duì)p55PIK的表達(dá)具有調(diào)控作用。

圖4 p53低表達(dá)上調(diào)p55PIK表達(dá)Fig.4 Knockdown of p53up-regulated the expression of p55PIK

2.3 p53通過抑制p55PIK調(diào)控SMMC-7721細(xì)胞增殖

在SMMC-7721細(xì)胞中進(jìn)行以下分組轉(zhuǎn)染:si-NC組、si-p53組、si-p53聯(lián)合si-p55組。在轉(zhuǎn)染后通過CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化。si-NC組 72h、96h的平均A值分別為（0.720±0.045）、（0.924±0.029）；si-p53組分別為（0.843±0.037）、（1.150±0.056）；si-p53聯(lián)合si-p55組分別為（0.789±0.023）、（1.043±0.067）。結(jié)果提示從72 h開始，si-p53組A值均高于si-NC及si-p53聯(lián)合si-p55組（P＜0.05）；si-p53聯(lián)合si-p55組A值均高于si-NC組（P＜0.05）（圖5）。此結(jié)果提示，p53對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用部分通過調(diào)控p55PIK的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

圖5 p53對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用部分依賴于p55PIKFig.5 p53inhibited live cancer cell proliferation，partially depending on p55PIK

3 討論

肝癌是世界上發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤，每年造成的死亡人數(shù)在所有癌癥中排第3位，我國是世界上肝癌發(fā)病率和病死率最高的國家［11］。雖然隨著手術(shù)技術(shù)不斷提高，肝癌的手術(shù)成功切除率也不斷提高，但由于其發(fā)病隱匿，對(duì)化療不敏感，目前總體預(yù)后仍然不夠理想。因此，對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的進(jìn)一步揭示是目前醫(yī)學(xué)界亟待解決的重大問題。p55PIK是PI3K信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)亞基，現(xiàn)已證實(shí)在多種腫瘤中可通過影響細(xì)胞增殖促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3，5－6，12－13］。我們通過siRNA技術(shù)構(gòu)建低表達(dá)p55PIK的細(xì)胞模型，通過CCK8實(shí)驗(yàn)首次在肝癌細(xì)胞模型中證明p55PIK低表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞生長；通過流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了p55PIK低表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期G0／G1期阻滯。通過這一組經(jīng)典分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，本研究首次系統(tǒng)論證了p55PIK可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。這一結(jié)論與此前所報(bào)道的p55PIK在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌中的生物學(xué)作用是相一致的［3，12－13］。

此前已有較多對(duì)p55PIK下游的信號(hào)調(diào)控通路的具體研究，然而p55PIK上游的調(diào)控機(jī)制目前已有的報(bào)道甚少。同時(shí)p53在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到十分重要的作用，是經(jīng)典抑癌基因，而在肝癌中也存在廣泛的失活突變［14－18］。由此我們?cè)O(shè)想在肝癌的發(fā)生發(fā)展中，p53與p55PIK存在潛在聯(lián)系。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們通過Western blot證實(shí)了p53可抑制p55PIK蛋白表達(dá)。通過CCK8實(shí)驗(yàn)在功能上進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)抑制p55PIK在一定程度上可逆轉(zhuǎn)低表達(dá)p53對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，證明了p55PIK是p53信號(hào)傳導(dǎo)通路的一個(gè)組成部分。至于p55PIK只能部分拮抗p53的功能，我們猜測(cè)這一現(xiàn)象可能是由于p55PIK是p53眾多下游信號(hào)通路中的一個(gè)分支，即使p55PIK信號(hào)通路受阻，p53也可通過其他信號(hào)通路發(fā)揮部分作用。因此，這證實(shí)了p53對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用部分依賴于p55PIK而實(shí)現(xiàn)。至此，我們基本對(duì)p55PIK與p53的關(guān)系與功能進(jìn)行了系統(tǒng)論證，然而p53對(duì)p55PIK的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探索，同時(shí)p55PIK在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能存在的其他生物學(xué)作用尚有待進(jìn)一步論證。

［1］ Wang G，Deng Y，Cao X，et al.Blocking p55PIK signaling inhibits proliferation and induces differentiation of leukemia cells［J］.Cell Death Differ，2012，11（19）:1870-1879.

［2］ Pons S，Asano T，Glasheen E，et al.The structure and function of p55PIK reveal a new regulatory subunit for phosphatidylinositol 3-kinase［J］.Mol Cell Biol，1995，15（8）:4453-4465.

［3］ Hu J，Liu S，Wang J，et al.Overexpression of the N－terminal end of the p55gamma regulatory subunit of phosphatidylinositol 3-kinase blocks cell cycle progression in gastric carcinoma cells［J］.Int J Oncol，2005，26（5）:1321-1327.

［4］ 鄧豫，王桂華，左學(xué)良，等.TAT-N24穿膜融合多肽對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30（7）:843－845.

［5］ Wang G，Chen C，Yang R，et al.p55PIK-PI3Kstimulates angiogenesis in colorectal cancer cell by activating NF-κB pathway［J］.Angiogenesis，2013，16（3）:561－573.

［6］ Xia X，Cheng A，Akinmade D，et al.The N-terminal 24amino acids of the p55gamma regulatory subunit of phosphoinositide 3-kinase binds Rb and induces cell cycle arrest［J］.Mol Cell Biol，2003，23（5）:1717-1725.

［7］ Wang G，Cao X，Lai S，et al.PI3Kstimulates DNA synthesis and cell-cycle progression via its p55PIK regulatory subunit interaction with PCNA［J］.Mol Cancer Ther，2013，12（10）: 2100-2109.

［8］ Hermeking H.MicroRNAs in the p53network:micromanagement of tumour suppression［J］.Nat Rev Cancer，2012，12（9）:613-626.

［9］ Termén S，Tan E，Heldin C，et al.p53regulates epithelialmesenchymal transition induced by transforming growth factorβ［J］.J Cell Physiol，2013，228（4）:801-813.

［10］ He L，He X，Lim L P，et al.A microRNA component of the p53tumour suppressor network［J］.Nature，2007，447（7148）:1130-1134.

［11］ Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）:69-90.

［12］ Hu J，Xia X，Cheng A，et al.A peptide inhibitor derived from p55PIK phosphatidylinositol 3－kinase regulatory subunit:a novel cancer therapy［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（12）:3719-3728.

［13］ 李襄，胡藝冰，孫黎，等.下調(diào)p55PIK基因表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外增殖和遷移能力的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，41（6）:643－646.

［14］ Muller P A，Vousden K H.p53mutations in cancer［J］.Nat Cell Biol，2013，15（1）:2-8.

［15］ 田敏，吳窮.p53基因在原發(fā)性肝癌中的研究進(jìn)展［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2013，11（9）:1445-1460.

［16］ Lim S，Kim H，Jung G.p53inhibits tumor cell invasion via the degradation of snail protein in hepatocellular carcinoma［J］.FEBS Letters，2010，584（11）:2231-2236.

［17］ 孔德光，吳高松.p53與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其機(jī)制［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，43（6）:720-722.

［18］ 郭成，段建峰，劉青光，等.野生型-p53與JunB融合基因?qū)β闶蟾渭?xì)胞肝癌移植瘤的抑制作用［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，42（6）:703-706.

（2015-01-22 收稿）

p53 Inhibits the Proliferation of Liver Cancer Cell Line SMMC-7721 by Targeting p55PIK

Fu Yinjia1，Yang Xi1，Cao Xiaonian2et al
1 Cancer Research Institute／Department of Gastrointestinal Surgery，2Department of Thoracic Surgery，Tongji Hosptial，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To examine the effects of p55PIK on the proliferation of liver cancer cell line SMMC-7721and the possible regulative mechanism of the upstream molecules of p55PIK.Methods p55PIK downexpression models were established by transfecting p55PIK-specific siRNA si-p55into SMMC-7721cells with lipofectamine.CCK8assay was used to investigate the impact of p55PIK on the proliferation of SMMC-7721cells.The effect of p55PIK on cell cycle was determined by flow cytometry（FCM）.si-p53，a siRNA targeting p53，was used to detect the impact of p53on the expression of p55PIK by Western blot and on the proliferation of SMMC-7721cells by using CCK8assay.Results Knockdown of p55PIK in liver cancer cell line SMMC-7721inhibited the cell proliferation［96hafter transfection，A-value in si-NC and si-p55were respectively（1.325± 0.050）and（1.183±0.019）］and induced cell cycle arrest in G0／G1－phase［（39.07±2.02）%in si-NC and（49.66±1.05）%in si-p55］.Low-expressing of p53could up-regulate the expression of p55PIK in SMMC-7721cells.Knockdown of p55PIK attenuated the impact of p53-knockdown on promoting the proliferation of SMMC-7721cells.Conclusion p53can inhibit the proliferation of liver cancer SMMC-7721cells partially by down-regulating the expression of p55PIK.

hepatic carcinoma； p55PIK； p53； cell proliferation

R735.7

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.001

＊國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30973496），國家青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81301899）

傅寅佳，男，1986年生，博士研究生，E－mail:fuyinjia＠hust.edu.cn

△通訊作者，Corresponding author，E-mail:54261592＠qq.com