來吉祥,何聰芬,方 云,趙 亞,魏少敏,,*

(1.江南大學,化學與材料工程學院,江蘇無錫 214122;2.北京工商大學理學院,北京 100048;3.上海家化聯(lián)合股份有限公司,上海 200082)

萌芽黑豆中蛋白質組分分子量分布及其抗氧化活性研究

來吉祥1,何聰芬2,方 云1,趙 亞3,魏少敏1,3,*

(1.江南大學,化學與材料工程學院,江蘇無錫 214122;2.北京工商大學理學院,北京 100048;3.上海家化聯(lián)合股份有限公司,上海 200082)

本文目的是研究萌芽黑豆中不同蛋白質組分的分子量分布,以及各組分的抗氧化活性。采用堿提酸沉法獲得萌芽黑豆中的蛋白質,通過硫酸銨鹽析法逐級分離各蛋白質組分,SDS-PAGE法測定各蛋白質組分分子量分布,并從清除自由基和抗人皮膚成纖維細胞氧化損傷兩個方面研究了各蛋白質組分的抗氧化活性。萌芽黑豆中蛋白質組分可以集中分離為三個部分,其分子量分布為140.0～166.0、45.0～72.0、17.0～23.0ku;清除自由基和抗人皮膚成纖維細胞氧化損傷的實驗結果均表明分子量在17.0～23.0ku的蛋白質組分具有最優(yōu)的抗氧化活性,說明低分子量的萌芽黑豆蛋白質具有更強的抗氧化活性。

萌芽黑豆,蛋白質,分子量分布,抗氧化活性

黑豆,又名黑大豆、櫓豆、烏豆,味甘性平,具有高蛋白、低熱量的特性。在常見的食用豆中,黑豆具有最為顯著的抗氧化生物活性[1]。研究發(fā)現(xiàn),黑豆在萌發(fā)的過程中,由于酶的作用,其中的蛋白質、多糖和礦物質元素等營養(yǎng)成分會被釋放出來,增加人體吸收利用率[2];黃酮類物質也發(fā)生了有益的轉化[3],皂苷和非糖基化的黃酮醇含量顯著增加[4-5];同時,萌發(fā)過程能夠促進蛋白質分解為氨基酸,有利于提高黑豆的營養(yǎng)價值[6]。黑豆提取物具有強抗氧化功效[7],已有研究發(fā)現(xiàn),黑豆中的抗氧化活性成分主要是多酚類物質[8]、花色苷[9]、酚酸、花青素、異黃酮[10]、肽[11-12]等,目前關于黑豆功效的研究也都是圍繞這些活性成分展開的。作者前期研究發(fā)現(xiàn):黑豆經過萌發(fā)后,其蛋白質含量和抗氧化活性均發(fā)生顯著變化,且兩者呈正相關變化,其中萌芽初期黑豆(芽長0.5cm)的蛋白質含量最高,這一階段黑豆萌芽的抗氧化活性也最優(yōu)異[13],推測是由于萌芽過程促使黑豆中的蛋白質發(fā)生了有益的轉化,生成小分子量的蛋白質,其生物活性也發(fā)生了變化,但目前關于黑豆蛋白質抗氧化活性的研究還鮮見報道。因此,本研究采用硫酸銨鹽析法分級分離萌芽黑豆(芽長0.5cm)中的蛋白質,并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(SDS-PAGE)分析各蛋白質組分的分子量分布,采用清除自由基實驗和抗人皮膚成纖維細胞氧化損傷實驗對各蛋白質組分的抗氧化活性進行評價,驗證萌芽黑豆中蛋白質的抗氧化活性,并研究其中抗氧化活性最強的蛋白質組分及其分子量分布,為黑豆及其萌芽中蛋白質資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆(Soybean(Glycinemaxvar)) 產地河北石家莊,青仁黑豆,當年新豆;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),水楊酸,H2O2(3%),噻唑藍(MTT),二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基,小牛血清 美國Gibco公司;維生素C,丙酮,苯酚,無水硫酸銨 國藥集團化學試劑有限公司。

Spectra Max Plus 384連續(xù)光譜掃描式酶標儀 美國Molecular Devices公司;UV2300紫外可見分光光度計 日本島津公司;4K15高速冷凍離心機 Sigma公司;KQ-400KDB型超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司;JHBE-50T型閃式提取器 西安太康生物科技有限公司;巧夫人智能型家用豆芽機 瑞安市威鵬家用電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑豆萌芽過程 選取優(yōu)質的青仁黑豆,籽粒飽滿,色澤烏黑,無蟲蛀,無破損,豆長9～10mm,直徑約7mm,百粒重約30g左右。稱取10g黑豆干種子,用去離子水清洗表面灰塵及細菌,加入去離子水200mL,放置于30℃下浸泡16h,期間每4h換水1次。將泡發(fā)的黑豆種子用去離子水清洗干凈,均勻擺放在家用豆芽機中,置于黑暗處進行萌發(fā),保持溫度在30℃左右。豆芽機可自動噴淋,每60min噴淋一次,每次60s。每24h為豆芽機更換一次去離子水,并對豆芽機和豆芽進行清洗。約36h后黑豆開始萌芽,48h后芽長達0.5cm,采收備用。

1.2.2 蛋白質提取及分離純化 參考文獻方法[14],采用超聲輔助水提法提取萌芽黑豆中的蛋白質,按照1∶30的料液比加入去離子水,采用閃式提取器,于40V電壓下粉粹3min,室溫在40kHz功率下超聲提取30min;參考文獻,采用堿提酸沉法[15]分離蛋白質:取超聲后的萌芽黑豆提取液500mL,用2mol/L的NaOH調整混合物的pH至8.0,勻速攪拌15min,增加蛋白質在堿性溶液中的溶解度,200目紗布過濾,5000r/min離心15min,取上清液,加入稀鹽酸調整上清液的pH至4.5,靜置20min,待蛋白質充分沉淀后,5000r/min離心15min,用等體積丙酮洗滌沉淀,沉淀在室溫下自然干燥,即獲得萌芽黑豆蛋白質干粉,備用。

1.2.3 硫酸銨鹽析法分級分離蛋白組分 參考文獻方法[16-18],取上述萌芽黑豆酸沉蛋白沉淀0.5g,加入25mL蒸餾水制成萌芽黑豆蛋白溶液,分6級調節(jié)硫酸銨的飽和度,分別為30%、45%、60%、75%、90%和100%,每一級分離過程中,邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨,直到達到相應的飽和度,充分攪拌后,在4℃冰箱中靜置4h,然后在10000r/min條件下離心20min,沉淀即為分級分離的蛋白。將上清液重復上述操作,補加硫酸銨達到相應的下一個飽和度,再次攪拌、靜置、離心得沉淀。以此類推,按級不斷增大硫酸銨的飽和度,直到100%,對萌芽黑豆水提液中的蛋白質進行分級分離。各分級分離的蛋白質分別溶于5mL去離子水中,采用3500分子量的透析袋透析24h,去除硫酸銨,冷凍干燥獲得萌芽黑豆分級蛋白質。每個樣品平行測定3次,取平均值作為各蛋白質組分的含量。

1.2.4 蛋白質組分分子量分布測定 參考文獻方法[19],利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定蛋白質分子量分布:配制含10%丙烯酰胺的分離膠,凝固后加入含5%丙烯酰胺的濃縮膠,將萌芽黑豆各分級蛋白質組分加入樣品緩沖液中,煮沸5min,冷卻后各取20μL加入至十二烷基硫酸納-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。初始電流8mA,當染料進入分離膠后將電流提高至11mA。電泳結束后將凝膠加入含有考馬斯亮藍R-250的染色液中60℃染色5min,轉移至脫色液中脫色。

1.2.5 各組分清除自由基抗氧化活性

1.2.5.1 清除羥基自由基(OH·)活性 采用水楊酸法[20]檢測萌芽黑豆蛋白質組分清除OH·的活性。在10mL比色管中加入2mmol/L FeSO4溶液3mL、6mmol/L水楊酸溶液3mL、5mg/mL萌芽黑豆蛋白質水溶液1mL,搖勻;接著加入1mmol/L H2O2溶液3mL,搖勻,啟動反應;于37℃水浴保溫60min后取出,在510nm處測其吸光度;以維生素C作為陽性對照,樣品對OH·清除率的計算公式如下:

Y(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

式(1)

式中:Y為樣品對OH·清除率;A0為空白組吸光度值;A1為樣品組吸光度值;A2為樣品本底吸光度值。每個樣品平行測定3次,結果以平均值±標準差表示。

Y(%)=(1-V1/V0)×100

式(2)

1.2.5.3 清除DPPH自由基(DPPH·)活性 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)是一種穩(wěn)定的有機自由基,可用來評價樣品清除自由基的能力。以維生素C作為陽性對照,參考文獻[22-23]的方法,取3mL的5mg/mL萌芽黑豆蛋白質水溶液于10mL試管中,加入3mL體積的2×10-4mol/L的DPPH溶液,快速混勻;向3mL DPPH 溶液中加入3mL無水乙醇,記錄吸光值為A0,即空白對照;室溫避光放置30min;用分光光度計測量其在517nm處的吸光值,記錄為A1,樣品對DPPH·清除率的計算公式如下:

Y(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

式(3)

式中:Y為樣品對DPPH·清除率,A0為空白組吸光度值,A1為樣品組吸光度值,A2為樣品本底吸光度值。每個樣品平行測定3次,結果以平均值±標準差表示。

1.2.6 抗H2O2誘導的人皮膚成纖維細胞氧化損傷實驗 通過MTT法檢測萌芽黑豆蛋白質組分抗H2O2誘導的人皮膚成纖維細胞氧化損傷的活性。參考任德成等人[24]的實驗方法,采用第3代人皮膚成纖維細胞,運用紫外分光光度法,在570nm波長下檢測細胞的存活率。細胞分為三組:(1)H2O2預先作用組——將人皮膚成纖維細胞預先與濃度為800μmol/L的H2O2孵育4h,然后再與萌芽黑豆蛋白質(1mg/mL)孵育12h;(2)同時作用組——將萌芽黑豆各蛋白質組分(1mg/mL)與濃度為800μmol/L的H2O2同時作用于人皮膚成纖維細胞,孵育12h;(3)蛋白質預先孵育組——將人皮膚成纖維細胞預先與萌芽黑豆蛋白質(1mg/mL)孵育12h,然后再與濃度為800μmol/L的H2O2作用4h。

MTT法檢測細胞存活率 人皮膚成纖維細胞,在37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,采用第3代的細胞進行實驗,接種密度為5×104cells/mL,培養(yǎng)24h,細胞融合達到70%。用含有萌芽黑豆蛋白質組分的成纖維細胞生長培養(yǎng)基制成細胞懸液,培養(yǎng)基為空白對照,細胞密度為5×104cells/mL,接種在96孔細胞培養(yǎng)板上,每孔200μL(1×104cells/孔)。在37℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗結束前4h,每孔加入MTT 20μL,培養(yǎng)4h后棄上清,然后每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)震蕩15min,使結晶充分溶解。置于酶聯(lián)免疫檢測儀上,以波長570nm測定各孔吸光度值。細胞存活率的計算公式如下:

Y(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100

式(4)

式中:Y為細胞存活率,A0為培養(yǎng)基體系本底吸光度值,A1為樣品組吸光度值,A2為非氧化損傷組吸光度值。每1種蛋白質組分設6個復孔,重復2次實驗,結果以平均值±標準差表示。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 應用統(tǒng)計學軟件SPSS v19.0分析處理實驗數(shù)據(jù),采用組間單因素方差分析進行數(shù)據(jù)處理,當p<0.05時,認為在統(tǒng)計學上有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 蛋白質組分分子量分布

萌芽黑豆蛋白質組分的分子量分布如表1所示:

表1結果表明:萌芽黑豆中各蛋白質組分的分子量主要集中分布在140.0～166.0、45.0～72.0、17.0～23.0ku三個范圍內。隨著硫酸銨飽和度的升高,大分子量的蛋白質首先沉淀出來,主要集中在140.0～166.0ku,含量約占總蛋白的9.8%;然后是分子量45.0～72.0ku的蛋白質,含量最多,約占總蛋白的35.4%;最后沉淀的是小分子量的蛋白質,17.0～23.0ku,含量約占總蛋白的27.7%。

表1 萌芽黑豆分級分離蛋白質的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of proteins in germinal black soybeans

2.2 蛋白質組分清除自由基活性

2.2.1 清除羥基自由基活性 萌芽黑豆中蛋白質對羥基自由基的清除活性如圖1所示:萌芽黑豆中的蛋白質對羥基自由基具有清除活性,但不同分子量范圍蛋白質的清除活性有顯著差異,其中小分子量的蛋白質(17.0～23.0ku)對羥基自由基具有最優(yōu)異的清除活性,顯著高于其他分子量的蛋白質(p<0.05)。

圖1 萌芽黑豆中蛋白質組分清除羥基自由基活性Fig.1 OH· scavenging activities of proteins in germinal black soybeans

2.2.2 清除超氧陰離子自由基活性 萌芽黑豆中蛋白質對超氧陰離子自由基的清除活性如圖2所示:萌芽黑豆蛋白質對超氧陰離子自由基具有清除活性,其中小分子量蛋白質(17.0～23.0ku)的清除活性最佳,清除率可達70%以上,與其他分子量的蛋白質相比具有顯著性差異(p<0.05)。

圖2 萌芽黑豆中蛋白質組分清除超氧陰離子自由基活性Fig.· scavenging activities of proteins in germinal black soybeans

2.2.3 清除DPPH自由基活性 萌芽黑豆中蛋白質對DPPH自由基的清除活性如圖3所示:萌芽黑豆蛋白質可以清除DPPH自由基,其中小分子量蛋白質(17.0～23.0ku)的清除活性最佳,顯著高于其他分子量的蛋白質(p<0.05)。

圖3 萌芽黑豆中蛋白質組分清除DPPH自由基活性Fig.3 DPPH· scavenging activities of proteins in germinal black soybeans

綜合考察萌芽黑豆中蛋白質對羥基自由基,超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除活性研究結果,發(fā)現(xiàn)萌芽黑豆蛋白質具有清除自由基活性,低分子量的黑豆蛋白質(17.0～23.0ku)具有更強的抗氧化活性。推測可能是由于小分子量的蛋白質空間結構簡單,具有更多的活性基團,易于與自由基接觸,發(fā)揮抗氧化活性。已有研究發(fā)現(xiàn),與大分子量多肽相比,小分子量的黑豆肽和大豆肽也具有更優(yōu)的清除自由基活性[25-26];相關研究發(fā)現(xiàn),隨著分子量減小,大豆肽對DPPH自由基的清除效果明顯增高,其中分子量小于5000u的小肽具有最顯著的抗氧化活性[27];低分子量的大豆肽(5000～10000u)較其他分子量段的多肽具有更強的抗癌活性[28]。綜合分析可能有兩方面的原因:一方面與蛋白質或多肽中特定的氨基酸組成有關,特定的氨基酸殘基具有更好的電子供體;另一方面蛋白質或多肽中特定的氨基酸序列也與抗氧化活性有密切關系[29]。

2.3 抵御H2O2誘導的人皮膚成纖維細胞氧化損傷的作用

通過MTT法檢測萌芽黑豆蛋白質對H2O2誘導的人皮膚成纖維細胞損傷的作用結果如圖4所示:

圖4 萌芽黑豆蛋白質對H2O2引起的 人皮膚成纖維細胞損傷的作用Fig.4 Effect of proteins of black soybean on the human skin fibroblast damnified by H2O2注:a.H2O2預先作用組,b.同時作用組,c.蛋白質預先孵育組。

與空白對照相比,H2O2預先作用組中的細胞活力無顯著增加,但也沒有顯著下降。人皮膚成纖維細胞與H2O2預先孵育時,已經受到了氧化損傷,細胞存活率下降,再加入萌芽黑豆蛋白質,無法在短時間內消除H2O2引起的氧化損傷。在同時作用組中1～6各組萌芽黑豆蛋白質孵育的人皮膚成纖維細胞,細胞存活率與陰性對照接近,無顯著變化。這說明萌芽黑豆蛋白質和H2O2一起作用于人皮膚成纖維細胞時,細胞仍然遭受了H2O2的氧化損傷,萌芽黑豆蛋白質清除了一部分自由基,但保護細胞的作用不強。在蛋白質預先孵育組中細胞存活率顯著提高(p<0.05),說明使用萌芽黑豆蛋白質預先孵育細胞能夠顯著抵抗H2O2引起的氧化損傷。分析原因,可能是因為萌芽黑豆蛋白質在孵育的過程中,促進了人皮膚成纖維細胞的增殖,增強了細胞活力;然后再與H2O2作用時,萌芽黑豆蛋白質清除了H2O2產生的自由基,抵御了氧化損傷,使得整體細胞活力增強,細胞存活率增高。

綜合分析H2O2預先作用組,同時作用組,蛋白質預先孵育組的實驗結果,參考肖健等人[30]的報道,對三組數(shù)據(jù)進行比較研究,結果表明:H2O2預先作用組和同時作用組中,細胞存活率與空白對照均無顯著差異,但是,同時作用組略優(yōu)于H2O2預先作用組;蛋白質預先孵育組中細胞的存活率達到50%以上,其中,當萌芽黑豆蛋白質的分子量在17.0～23.0ku時,細胞的存活率最高,可達68.5%±5.26%,超出空白對照組(53.5%),明顯優(yōu)于其他分子量范圍的蛋白質(p<0.05)。實驗結果表明,萌芽黑豆蛋白質抵抗H2O2引起的人皮膚成纖維細胞損傷的作用包括兩個方面:一是直接的化學反應,通過直接清除自由基來進行;二是萌芽黑豆蛋白質促進了人皮膚成纖維細胞的增殖,增加了細胞活力。萌芽黑豆蛋白質為人皮膚成纖維細胞的生長與增殖提供了營養(yǎng)和物質基礎,增強了細胞活力。如果增加萌芽黑豆蛋白質的添加量,延長孵育時間,將可能會促進人皮膚成纖維細胞的增殖,提高細胞存活率。

3 結論

本研究以萌芽黑豆(芽長0.5cm)中的蛋白質為研究對象,通過清除自由基和抵御細胞氧化損傷實驗證實萌芽黑豆中的蛋白質具有抗氧化活性;通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)萌芽黑豆中各蛋白質組分的分子量主要集中分布在140.0～166.0、45.0～72.0、17.0～23.0ku三個范圍內,其中17.0～23.0ku范圍內的蛋白質組分具有最優(yōu)的清除自由基活性和抵御H2O2誘導的人皮膚成纖維細胞氧化損傷的作用。研究發(fā)現(xiàn),萌芽黑豆蛋白質抵御H2O2誘導的人皮膚成纖維細胞氧化損傷的作用主要包括兩個方面:一是直接清除自由基,二是促進細胞增殖,增加細胞活力。通過對萌芽黑豆蛋白質分子量分布及其各組分抗氧化活性的研究,為黑豆及其萌芽中蛋白質資源的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

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Study on molecular weight distribution and antioxidant activity of protein components in germinal black soybean

LAI Ji-xiang1,HE Cong-fen2,FANG Yun1,ZHAO Ya3,WEI Shao-min1,3,*

(1. School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2. School of Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;3. Shanghai Jahwa United Co. Ltd.,Shanghai 200082,China)

Molecular weight distribution and antioxidant activities of each protein composition in germinal black soybean were studied. Protein components in germinal black soybean were extracted and separated by ammonium sulfate method. Molecular weight distribution of each protein component was measured using SDS-PAGE method,and antioxidant activity were studied by free radicals scavenging test and anti-H2O2-induced damaged skin fibroblast test. Molecular weight of proteins in germinal black soybean was concentrated in 140.0～166.0,45.0～72.0,17.0～23.0ku. Results of antioxidant activity tests showed that the protein component of 17.0～23.0ku molecular weight had the best antioxidant activity indicating that low molecular weight germinal black soybean protein had stronger antioxidant activity.

germinal black soybean;protein;molecular weight distribution;antioxidant activity

2014-02-18

來吉祥(1983-),男,博士研究生,研究方向:植物源化妝品功效添加劑研究。

*通訊作者:魏少敏(1952-)，男，博士，教授，主要從事精細化學品科學研究。

國家自然科學基金(21276113);國家科技支撐計劃項目(2011BAD23B03)。

TS214.9

A

1002-0306(2015)01-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.001