李 波,包怡紅,高 鋒,王振宇

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研處,黑龍江哈爾濱 150086;3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150086)

紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

李 波1,2,包怡紅1,*,高 鋒3,王振宇1

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研處,黑龍江哈爾濱 150086;3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150086)

本文研究了紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法分析了其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明,紅松松球鱗片多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用略弱于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖,二者的半數(shù)抑制濃度分別為713.94μg/mL和623.73μg/mL;對(duì)α-淀粉酶的抑制作用明顯不及陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖,二者的半數(shù)抑制濃度分別為1902.91μg/mL和865.96μg/mL。動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型。

紅松松球鱗片,多酚,α-淀粉酶,α-葡萄糖苷酶,抑制

餐后高血糖的發(fā)生與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性密切相關(guān),這兩種酶的活性越強(qiáng),水解淀粉和低聚糖的量也就越多,進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖在小腸黏膜上吸收加快[1]。因此,抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性是控制餐后血糖升高的一個(gè)重要途徑,也就是說(shuō),通過(guò)對(duì)這兩種酶的抑制作用能夠有效降低餐后高血糖的發(fā)生[2]。一直以來(lái),植物多酚有益于人類健康的生物活性備受研究學(xué)者關(guān)注。目前已研究證實(shí),植物多酚不僅能夠減少氧化應(yīng)激作用,而且能夠通過(guò)抑制碳水化合物水解酶的作用來(lái)預(yù)防高血糖[3-4]。

我國(guó)紅松資源豐富,但對(duì)其多酚類物質(zhì)的研究還很少。本項(xiàng)研究前期實(shí)驗(yàn)表明,紅松松球鱗片含有豐富的多酚類物質(zhì),而且該類多酚具有很好的抗氧化性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法研究其動(dòng)力學(xué)性質(zhì),揭示紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松松球鱗片 收集于2011年9月份,地點(diǎn)在黑龍江省伊春林區(qū),自然晾干后粉碎過(guò)60目篩,其乙醇提取液經(jīng)AB-8樹脂柱層析純化、Sephadex LH-20凝膠柱層析純化后,減壓濃縮,冷凍干燥得純化的紅松松球鱗片多酚(PP,Purified Polyphenol)粉末；豬胰α-淀粉酶(PPA)、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG) 購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;ELx800NB 酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司;PHS-3C型數(shù)字酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;FA2004型電子天平 上海天平儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 α-淀粉酶活性抑制實(shí)驗(yàn) α-淀粉酶活性測(cè)定參照張永軍等[5]的方法,略加修改。取20μL α-淀粉酶溶液,分別加入20μL不同濃度的多酚溶液,混合均勻后置于37℃水浴中預(yù)熱,然后加入40μL預(yù)熱到37℃的1%淀粉溶液,在該溫度下反應(yīng)3min后,立即加入80μL DNS顯色溶液,沸水浴8min,冷至室溫后,加800μL蒸餾水稀釋,用酶標(biāo)儀于540nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值A(chǔ)2。另取20μL磷酸鹽緩沖溶液代替多酚溶液,測(cè)得無(wú)抑制劑時(shí)酶反應(yīng)體系的吸光值A(chǔ)1,計(jì)算出抑制率,并進(jìn)行多元非線性擬合,利用回歸方程求出半數(shù)抑制濃度。抑制率計(jì)算公式為:

抑制率(%)=[(A1-A2)/A1]×100

式(1)

式中：A1和A2分別代表無(wú)抑制劑和有抑制劑時(shí)的酶反應(yīng)體系的吸光值。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn) α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定參照Xu Hai-Wei等[6]的方法,并略加修改。分別取不同濃度的多酚溶液100μL,加入1U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液50μL,37℃水浴10min后,加入已經(jīng)預(yù)熱到37℃、5mmol/L的底物PNPG溶液50μL,37℃水浴10min,立即加入1mol/L的Na2CO3溶液100μL,用酶標(biāo)儀于405nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)2,另取100μL磷酸鹽緩沖溶液代替多酚溶液,測(cè)得無(wú)抑制劑時(shí)酶反應(yīng)體系的吸光值A(chǔ)1,按照式(1)計(jì)算出抑制率,并進(jìn)行多元非線性擬合,利用回歸方程求出半數(shù)抑制濃度。

1.2.3 動(dòng)力學(xué)分析 固定底物濃度,改變酶濃度,分別測(cè)定添加和不添加紅松松球鱗片多酚時(shí)反應(yīng)體系的吸光值,并計(jì)算酶反應(yīng)速率,然后根據(jù)酶反應(yīng)速率與酶濃度之間的變化關(guān)系作圖,判斷其抑制類型是否可逆。

固定酶濃度,改變底物濃度,分別測(cè)定添加和不添加紅松松球鱗片多酚時(shí)反應(yīng)體系的吸光值,并計(jì)算酶反應(yīng)速率,按照Lineweaver-Burk作圖法,以酶反應(yīng)速率的倒數(shù)對(duì)底物濃度的倒數(shù)作圖,求得米氏方程。根據(jù)方程確定米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax,通過(guò)比較有無(wú)紅松松球鱗片多酚存在時(shí)的Km和Vmax的變化來(lái)判斷其可逆性抑制類型。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析處理 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,取平均值。采用Excel軟件進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶抑制作用分析

2.1.1 半數(shù)抑制濃度的確定 圖1所示的是紅松松球鱗片多酚和陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用結(jié)果。由圖可知,隨著二者濃度的增加,其對(duì)α-淀粉酶的抑制作用也都在增強(qiáng),呈現(xiàn)了良好的量效關(guān)系。但是在整個(gè)測(cè)試濃度范圍內(nèi),陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用要顯著優(yōu)于紅松松球鱗片多酚,通過(guò)比較二者的EC50值,我們也可以確認(rèn)這一點(diǎn),紅松松球鱗片多酚的EC50值為1902.91μg/mL,而阿卡波糖的EC50值僅為865.96μg/mL。

圖1 不同濃度多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of polyphenol on α-amylase

2.1.2 抑制類型的確定 紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線如圖2所示。當(dāng)反應(yīng)體系中有可逆性抑制劑存在時(shí),得到的直線通過(guò)原點(diǎn),但斜率小于無(wú)抑制劑的直線斜率,當(dāng)體系中存在不可逆抑制劑時(shí),得到的直線不通過(guò)原點(diǎn)[7-8]。因此由圖2可推斷出,紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制類型為可逆性抑制。

圖2 多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetics curves of inhibition of α-amylase

2.1.3 可逆性抑制類型的確定 可逆性抑制一般分為四種類型,即為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制和混合性抑制。在確定抑制機(jī)理時(shí),根據(jù)抑制作用的雙倒數(shù)圖,分別計(jì)算出無(wú)抑制劑和有抑制時(shí)反應(yīng)體系的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax,通過(guò)比較二者的變化,即可推斷出可逆性抑制類型[9]。

圖3所示的是固定α-淀粉酶濃度,在不添加和添加紅松松球鱗片多酚(2mg/mL)條件下,改變底物淀粉的濃度(0.5%～2%),得到的Lineweaver-Burk曲線。由圖可以看出,兩條直線相交于橫軸。通過(guò)兩條直線方程計(jì)算得出,有抑制存在時(shí),米氏常數(shù)Km值17.42mg/mL,最大反應(yīng)速度Vmax為0.5049mg/mL·min;無(wú)抑制劑存在時(shí),米氏常數(shù)Km值16.49mg/mL,最大反應(yīng)速度Vmax為1.045mg/mL·min。由此可知,和無(wú)抑制劑時(shí)相比,當(dāng)紅松松球鱗片多酚存在時(shí),α-淀粉酶催化淀粉的酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速Vmax降低了,而米氏常數(shù)Km基本保持不變,因此推測(cè)紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶屬非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型。

圖3 多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk plot for inhibition of polyphenol on α-amylase

2.2 紅松松球鱗片多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用分析

2.2.1 半數(shù)抑制濃度的確定 通過(guò)測(cè)定不同濃度的紅松松球鱗片多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率,并以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照,來(lái)確定多酚的抑制作用,其結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出,隨著紅松松球鱗片多酚濃度的增加,其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用也在增強(qiáng),呈現(xiàn)了良好的量效關(guān)系。濃度在1000～2000μg/mL范圍內(nèi),紅松松球鱗片多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用同阿卡波糖相近,這也說(shuō)明了紅松松球鱗片多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶有很好的抑制效果。但通過(guò)比較二者的EC50值,我們發(fā)現(xiàn)紅松松球鱗片多酚(EC50,713.94μg/mL)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力略弱于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖(EC50,623.73μg/mL)。

圖4 不同濃度多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of polyphenol on α-glucosidase

2.2.2 抑制類型的確定 通過(guò)測(cè)定不同α-葡萄糖苷酶酶濃度在添加和不添加抑制劑(多酚濃度為750μg/mL)時(shí)的酶反應(yīng)速率,得到多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線,如圖5所示。由圖5可知,紅松松球鱗片多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型為可逆性抑制。

圖5 多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 Kinetics curves of inhibition of α-glucosidase

2.2.3 可逆性抑制類型的確定 固定α-葡萄糖苷酶濃度,在不添加和添加紅松松球鱗片多酚(750μg/mL)條件下,改變底物PNPG的濃度(2～5mmol/L),測(cè)定反應(yīng)體系的反應(yīng)速率,得到α-葡萄糖苷酶在有無(wú)抑制劑存在時(shí)的Lineweaver-Burk曲線。根據(jù)圖6中的兩條直線方程可以計(jì)算出,有抑制存在時(shí),米氏常數(shù)Km值5.867mmol/L,最大反應(yīng)速度Vmax為0.138mmol/Lmin;無(wú)抑制劑存在時(shí),米氏常數(shù)Km值5.929mmol/L,最大反應(yīng)速度Vmax為0.241mmol/Lmin。由此可知,和無(wú)抑制劑時(shí)相比,當(dāng)紅松松球鱗片多酚存在時(shí),α-葡萄糖苷酶催化PNPG的酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速Vmax降低了,而米氏常數(shù)Km基本保持不變,因此推測(cè)紅松松球鱗片多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶屬非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型。

圖6 多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的 抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.6 Lineweaver-Burk plot for inhibition of polyphenol on α-glucosidase

3 結(jié)論與討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑,如已廣泛應(yīng)用于臨床的阿卡波糖、伏格列波糖等對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都有很強(qiáng)的抑制作用,使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢,從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收,降低餐后高血糖。但是,這些抑制劑同時(shí)也具有一些副作用,像腹脹、腹痛、腹瀉、胃腸痙攣性疼痛、頑固性便秘等。先前的一些研究表明,這些副作用是抑制劑對(duì)α-淀粉酶的過(guò)度抑制導(dǎo)致了結(jié)腸部位未被吸收的碳水化合物經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的[10]。因此,更有效的抑制劑應(yīng)當(dāng)是在有效控制餐后高血糖的同時(shí),能減少這些副作用,即這種抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶有很強(qiáng)抑制作用,而對(duì)α-淀粉酶有較溫和的抑制作用[11-12]。

體外實(shí)驗(yàn)研究表明,紅松松球鱗片多酚可有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性,其作用效果雖然略弱于阿卡波糖,但是其對(duì)α-淀粉酶的抑制作用比較溫和,說(shuō)明該多酚組分不僅能對(duì)淀粉酶促水解直至生成葡萄糖的整個(gè)過(guò)程產(chǎn)生抑制作用,從而可有效延緩單糖的釋放和吸收,抑制餐后高血糖;而且還能避免或減緩對(duì)α-淀粉酶的過(guò)度抑制導(dǎo)致的一些副作用。抑制作用的動(dòng)力學(xué)分析表明,紅松松球鱗片多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制反應(yīng)類型均為可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

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Inhibitory effect of polyphenols from Korean pine cone lamella on α-amylase and α-glucosidase

LI Bo1,2,BAO Yi-hong1,*,GAO Feng3,WANG Zhen-yu1

(1.College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2.Department of Scientific Research Management,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China;3. Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

Inhibition kinetics of α-amylase and α-glucosidase by polyphenols from Korean pine cone lamella was studied. The results suggested that inhibitory activity of polyphenols(EC50,713.94μg/mL)on α-glucosidase was slightly lower than that of the positive control acarbose(EC50,623.73μg/mL)and inhibitory effect of polyphenols(EC50,1902.91μg/mL)on α-amylase was significantly lower than that of acarbose(EC50,865.96μg/mL). A Lineweaver-Burk plot indicated that the inhibition of polyphenols from Korean pine cone lamella on α-amylase and α-glucosidase were both uncompetitive.

Korean pine cone lamella;polyphenols;α-amylase;α-glucosidase;inhibition

2014-03-20

李波(1980-)，男，在讀博士，副研究員，主要從事植物活性成分的分離與開發(fā)。

*通訊作者:包怡紅(1970-)，女，博士，教授，主要從事功能性食品開發(fā)研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31170510)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)01-0063-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.004