曹璐璐，李斐，吳惠豐，趙建民

1. 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 中國(guó)科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 264003 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

BDE-47對(duì)人胚腎細(xì)胞HEK293的毒理效應(yīng)及作用機(jī)制

曹璐璐1,2，李斐1,*，吳惠豐1,#，趙建民1

1. 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 中國(guó)科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 264003 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)是生物體中含量最高且毒性最強(qiáng)的PBDEs之一，有關(guān)BDE-47對(duì)腎細(xì)胞的毒性及其作用機(jī)制的研究仍有待補(bǔ)充。選取3個(gè)劑量組(低：10-6mol·L-1、中：10-5mol·L-1、高：10-4mol·L-1)及溶劑對(duì)照組，研究了BDE-47對(duì)人胚腎細(xì)胞(HEK293)的細(xì)胞凋亡率及活性氧(ROS)水平的影響；并從分子水平對(duì)細(xì)胞氧化損傷、凋亡相關(guān)蛋白(APE1及p53)及凋亡相關(guān)基因mRNA (p53、Bax、Caspase 3、Caspase 8)的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，中、高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；ROS水平在中劑量組顯著上升(P<0.01)；隨BDE-47濃度的變化，APE1蛋白表達(dá)量與細(xì)胞ROS水平存在一致性；p53、Bax、Caspase 8 mRNA表達(dá)量與BDE-47的濃度間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，BDE-47可誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激，APE1可能是細(xì)胞ROS升高與細(xì)胞凋亡間重要的中介因子；BDE-47可以通過影響Caspase 8及線粒體途徑中p53及Bax的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)；人胚腎細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；氧化損傷；p53；Bax

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類溴代芳香族化合物，現(xiàn)今作為阻燃劑被廣泛應(yīng)用[1]。由于其難以降解且可遠(yuǎn)距離遷移，目前，已經(jīng)從多種環(huán)境介質(zhì)及生物體中檢測(cè)到PBDEs的存在，如土壤、大氣、沉積物、室內(nèi)空氣、貽貝、魚類、家禽及人體組織、體液等[2-4]。研究者綜合分析了全球已公布的人群監(jiān)測(cè)結(jié)果，認(rèn)為2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(2,2’,4,4’-tetra-bromodiphenyl ether, BDE-47)是與人群關(guān)系最密切的PBDEs同系物之一，而且它也是分布最廣、在生物體中含量最高、對(duì)人體和動(dòng)物毒性最強(qiáng)的PBDEs之一[5]。因此，BDE-47對(duì)于人體的潛在毒性作用受到了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)表明，BDE-47具有神經(jīng)毒性、肝腎毒性、生殖毒性及內(nèi)分泌干擾作用[6-13]。圍繞BDE-47細(xì)胞毒性的研究工作也已展開。那廣水等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47濃度達(dá)20 μg·mL-1以上便會(huì)對(duì)人肝細(xì)胞(L02)的增殖造成抑制。此外，有研究報(bào)道，一定劑量的BDE-47(>20 μmol·L-1)可引起L02細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)漏出率增加、細(xì)胞丙二醛(MDA)含量增加、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)以及超氧化物歧化酶(SOD)活力降低，表明BDE-47可誘導(dǎo)L02細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激[13]。He等[15]研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47對(duì)于人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)存在毒物興奮效應(yīng)，且不同濃度BDE-47(1、2、4、8 μg·mL-1)暴露細(xì)胞24 h后，細(xì)胞在8 μg·mL-1表現(xiàn)出明顯的凋亡、氧化應(yīng)激及DNA損傷現(xiàn)象。Yan等[16]通過研究指出，BDE-47誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象可能與活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平增高所造成的線粒體功能障礙有關(guān)。李晉等[17]則認(rèn)為，BDE-47導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯與凋亡可能與p53蛋白表達(dá)水平增加有關(guān)。腎臟是重要的排毒器官，若腎臟細(xì)胞受損，很可能影響腎臟功能的正常發(fā)揮[18-19]。目前，關(guān)于BDE-47的腎細(xì)胞毒性的研究尚不充分，且其毒性機(jī)制尚不明晰，本實(shí)驗(yàn)以人胚腎細(xì)胞(HEK293)為研究對(duì)象，采用低、中、高3種劑量BDE-47對(duì)其進(jìn)行暴露，觀察BDE-47對(duì)HEK293細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，并從分子水平初步探究這一系列毒理效應(yīng)的作用機(jī)制，為進(jìn)一步開展BDE-47的毒性作用機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HEK293細(xì)胞，由煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室連培文博士贈(zèng)予。

1.2 儀器與試劑

儀器：SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；INCO2/108型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)Memmert公司)；XDS-1B型倒置生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；FACSAria流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；MiniVE電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(美國(guó)GE公司)。

試劑：BDE-47(純度為99.5%，美國(guó)Chem Service公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素溶液(雙抗)以及磷酸鹽溶液(PBS)均購自美國(guó)Hyclone公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，純度>99%，美國(guó)MP Biomedicals公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；2’,7’-二氯熒光素雙乙酸鹽(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA，美國(guó)Sigma公司)；TRIzol總RNA提取試劑(日本寶生物工程株式會(huì)社)；SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)；脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶-1(APE1)兔抗人多克隆抗體購自美國(guó)Abcam公司；p53及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔抗人多克隆抗體購自美國(guó)Cloud-clone Corp公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(杭州華安生物技術(shù)有限公司)；HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根生化科技北京有限公司)；脫脂奶粉(純度>99%)及聚偏二氟乙烯膜(PVDF)均購自北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)在含10%(體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清、1%(體積百分?jǐn)?shù))雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度95%。3～4 d進(jìn)行傳代，直至細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3.2 BDE-47暴露溶液的配制

稱取適量的BDE-47溶于DMSO制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.2 mol·L-1)，于暴露前用DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的BDE-47暴露溶液，溶劑對(duì)照組則向培養(yǎng)基中加入等量的DMSO，各濃度組中DMSO的終濃度為0.1%(體積百分?jǐn)?shù))。

1.3.3 細(xì)胞暴露及收集

結(jié)合以往研究[15, 20-23]，BDE-47暴露濃度共分4組，即溶劑對(duì)照組和低、中、高劑量組(10-6、10-5、10-4mol·L-1)，每組設(shè)3個(gè)平行樣。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，接種密度約為105個(gè)·mL-1，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，吸棄上清培養(yǎng)液，加入不同濃度BDE-47暴露溶液；經(jīng)24 h暴露培養(yǎng)后吸棄上清溶液，用胰蛋白酶消化細(xì)胞2 min，加胎牛血清終止消化后加入PBS吹打洗滌細(xì)胞2次，離心收集細(xì)胞團(tuán)塊于1.5 mL離心管中，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.4 細(xì)胞凋亡及ROS水平檢測(cè)

細(xì)胞凋亡：經(jīng)暴露收集后，取約1×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μL凋亡試劑盒緩沖液使其重懸；將5 μL Annexin V-FITC加入細(xì)胞懸液中，混勻，室溫(18～20 ℃)避光孵育5 min；之后加入5 μL碘化丙啶(PI)混勻，再次室溫避光孵育5 min。使用流式細(xì)胞儀于500 nm激發(fā)波長(zhǎng)和530 nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)，計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞，用Cell Quest軟件獲取數(shù)據(jù)并分析細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞內(nèi)ROS水平：經(jīng)暴露收集后，取約1×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μL PBS緩沖液使其重懸；向細(xì)胞懸液中加入5×10-4mol·L-1的DCFH-DA溶液5 μL，混勻，18 ℃避光孵育1 h。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DCFH熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)APE1及p53蛋白的表達(dá)量檢測(cè)

選取與細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)的2個(gè)分子標(biāo)記蛋白APE1及p53，采用蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)BDE-47對(duì)這些蛋白表達(dá)量的影響。細(xì)胞經(jīng)暴露收集，加入200 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液吹打混勻，4 ℃裂解20 min后，經(jīng)14 000×g離心10 min，吸取上清液；使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度并調(diào)整各組蛋白濃度一致，按體積比例(蛋白∶上樣緩沖液 = 7∶1)加入十二烷基磺酸鈉(SDS)上樣緩沖液后，煮沸變性10 min，室溫冷卻后，4 ℃保存?zhèn)溆谩５鞍咨蠘恿繛槊靠?0 μg，采用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并通過電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入5 mL目的蛋白及內(nèi)參蛋白(GAPDH)的一抗稀釋液(APE1一抗稀釋比例為1∶1 000，p53為1∶500，GAPDH為1∶2 000)，4 ℃過夜。次日，用含0.05%吐溫-20的PBS緩沖液(PBST)漂洗PVDF膜3次，每次10 min；加入含HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗的PBST緩沖液，室溫孵育1 h，再用PBST緩沖液漂洗PVDF膜3次；使用HRP-DAB底物顯色試劑盒孵育10 min顯色，掃描后用凝膠定量分析軟件(Gel-Pro Analyzer，Version 3.0)對(duì)蛋白結(jié)果進(jìn)行分析。采用目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為結(jié)果，將對(duì)照組的值設(shè)為1，其余各組以相對(duì)倍數(shù)表示。

1.3.6 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測(cè)BDE-47對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響。細(xì)胞經(jīng)暴露收集，利用TRIzol法提取總RNA，采用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA質(zhì)量，A260/280在1.8～2.0為宜；總RNA經(jīng)70 ℃熱變性5 min后，通過反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，反應(yīng)條件為：42 ℃，1 h；95 ℃，5 min。以SYBR Green作為染料，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT分析法進(jìn)行相對(duì)定量分析。目的基因及內(nèi)參基因(HPRT1)的引物序列見表1。

1.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，顯著性檢測(cè)采用最小顯著差數(shù)法(LSD)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 BDE-47暴露對(duì)HEK293細(xì)胞凋亡及ROS水平的影響

細(xì)胞凋亡率及ROS水平如表2所示。與對(duì)照組相比，中、高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中劑量組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而在高劑量組中，ROS含量則顯著降低(P<0.01)。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

表2 BDE-47對(duì)HEK293細(xì)胞凋亡率及ROS(活性氧)水平的影響Table 2 Effects of BDE-47 on HEK293 cells apoptosis and ROS (reactive oxygen species) level

注：與溶劑對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Notes: The level of significance is set at*P<0.05,**P<0.01 vs. control.

2.2 BDE-47暴露對(duì)HEK293細(xì)胞中APE1及p53蛋白表達(dá)水平的影響 BDE-47暴露對(duì)HEK293細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡途徑產(chǎn)生影響，并且與濃度相關(guān)。由圖1中可以看出，相比對(duì)照組，APE1僅在中劑量組表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)；而p53蛋白的表達(dá)量隨濃度的升高表現(xiàn)出先增加后減少的現(xiàn)象(P<0.05)。2.3 BDE-47暴露對(duì)HEK293細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

BDE-47對(duì)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響如表3所示。與對(duì)照組相比，Caspase 3 mRNA表達(dá)水平并未隨BDE-47濃度而產(chǎn)生明顯變化，而其他基因的mRNA表達(dá)量隨BDE-47濃度的升高而逐漸增加。Bax mRNA的表達(dá)水平在高劑量組中明顯升高(P<0.05)；而p53 mRNA的表達(dá)量在中、高劑量組均顯著增加(P<0.05)；此外，Caspase 8 mRNA在高劑量組的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主程序性死亡，用以保障生命的穩(wěn)定性[24]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路復(fù)雜多樣，而ROS作為細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的重要參與者，亦引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛研究[13,15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在BDE-47中劑量組中，細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞內(nèi)ROS水平均有所上升。結(jié)合以往研究成果[15]，推測(cè)BDE-47暴露使HEK293細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。而高劑量的BDE-47使細(xì)胞凋亡增加，但細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低，這可能由于過高劑量的BDE-47造成大量細(xì)胞死亡并形成細(xì)胞碎片，造成細(xì)胞內(nèi)ROS無法被檢測(cè)。

圖1 BDE-47對(duì)HEK293細(xì)胞中APE1及p53 蛋白表達(dá)水平的影響注：圖中1為溶劑對(duì)照組(0.1% DMSO)，2為低劑量 組(10-6 mol·L-1)，3為中劑量組(10-5 mol·L-1)，4為高劑 量組(10-4 mol·L-1)；與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig. 1 Effects of BDE-47 on proteins (APE1 and p53) expression level in HEK293 cells Notes: 1 is control group (0.1% DMSO), 2 is low concentration group (10-6 mol·L-1), 3 is medium concentration group (10-5 mol·L-1) and 4 is high concentration group (10-4 mol·L-1). The level of significance is set at *P<0.05, **P<0.01 vs. control.

表3 BDE-47對(duì)HEK293細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響Table 3 Effects of BDE-47 on apoptosis-related genes mRNA expression level in HEK293 cells

注：與溶劑對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Notes: The level of significance is set at*P<0.05,**P<0.01 vs. control.

結(jié)合細(xì)胞水平的毒理效應(yīng)表現(xiàn)，從分子水平進(jìn)一步研究了BDE-47對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡相關(guān)的兩個(gè)蛋白(APE1及p53)表達(dá)量的影響及對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(p53、Bax、Caspase 3、Caspase 8)轉(zhuǎn)錄水平的影響，以系統(tǒng)闡明BDE-47對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性作用機(jī)制。APE1作為重要的氧化還原因子，可以通過改變半胱氨酸殘基在DNA中的定位，激活受控轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮重要的生理作用，這些轉(zhuǎn)錄因子涉及細(xì)胞增殖、分化和凋亡等重要細(xì)胞效應(yīng)[25]。已有研究指出，APE1在細(xì)胞中受ROS調(diào)控，氧化應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞中APE1表達(dá)量明顯增加[26]。在本實(shí)驗(yàn)中，APE1蛋白的表達(dá)量與細(xì)胞內(nèi)ROS水平在不同的劑量組中存在一致性，推測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升造成APE1表達(dá)量上調(diào)。此外，隨細(xì)胞功能狀態(tài)的不同，APE1既可發(fā)揮抑制凋亡的作用又可發(fā)揮促凋亡作用。其促凋亡機(jī)制主要通過激活下游的轉(zhuǎn)錄因子AP-1及p53蛋白介導(dǎo)凋亡[27-28]。本實(shí)驗(yàn)中，中劑量組同時(shí)檢測(cè)到APE1、p53蛋白表達(dá)量的上調(diào)與細(xì)胞凋亡率的上升，推測(cè)APE1的高表達(dá)可能促進(jìn)p53依賴的細(xì)胞凋亡。

p53是重要的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡的調(diào)控者，當(dāng)外源污染物刺激或內(nèi)源ROS升高導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷無法修復(fù)時(shí)，p53可通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]；Bax作為Bcl-2家族成員之一，具有促凋亡作用，其基因啟動(dòng)子區(qū)域有p53的結(jié)合位點(diǎn)，所以p53能夠促進(jìn)Bax的表達(dá)[30]。已有研究指出，在1～10 μmol·L-1范圍內(nèi)，SH-SY5Y細(xì)胞中p53及BaxmRNA表達(dá)量與BDE-47劑量呈現(xiàn)正向劑量效應(yīng)關(guān)系[31]，本實(shí)驗(yàn)在10-6～10-4mol·L-1檢測(cè)到相似現(xiàn)象，推測(cè)BDE-47暴露使HEK293細(xì)胞內(nèi)p53水平上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)Bax的表達(dá)，Bax轉(zhuǎn)移至線粒體與Bcl-2家族成員協(xié)同調(diào)節(jié)使通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開放，造成線粒體中凋亡相關(guān)因子(細(xì)胞色素c或凋亡誘導(dǎo)因子AIF等)被釋放至胞質(zhì)中，激活下游凋亡因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32-33]。p53蛋白與mRNA在高劑量組的表達(dá)水平存在差異，推測(cè)為翻譯后修飾的結(jié)果。Caspase家族是凋亡的主要參與者，Caspase 8屬于凋亡啟動(dòng)因子，位于凋亡級(jí)聯(lián)效應(yīng)的頂端，幾乎可以激活所有下游的Caspase[34]；同時(shí)，Caspase 8也可以啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，其可將Bid (Bcl-2家族促凋亡因子)剪切為tBid，tBid轉(zhuǎn)移定位于線粒體，與Bcl-2家族其他成員共同作用促使凋亡的進(jìn)行[35-36]。已有研究指出，一定劑量(5、10 μmol·L-1)的BDE-47可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞中Caspase 8 mRNA表達(dá)量上調(diào)[37]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性，說明外源死亡受體途徑激活Caspase 8后，其可能通過Caspase家族的凋亡級(jí)聯(lián)效應(yīng)或線粒體途徑參與HEK293的細(xì)胞凋亡過程。線粒體除釋放細(xì)胞色素c激活Caspase依賴的凋亡途徑外，還可通過釋放AIF等啟動(dòng)非Caspase依賴的凋亡途徑[38]。凋亡執(zhí)行因子Caspase3 mRNA表達(dá)量在各劑量組中均無明顯變化，指示HEK293細(xì)胞在凋亡最后的執(zhí)行階段，可能通過Caspase家族其他凋亡執(zhí)行因子(Caspase 6及Caspase 7)或非Caspase依賴的途徑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，一定劑量的BDE-47可誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡產(chǎn)生ROS；結(jié)合翻譯水平及轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果推測(cè)：ROS的產(chǎn)生可誘導(dǎo)APE1的上調(diào)，進(jìn)而激活下游轉(zhuǎn)錄因子p53；p53可促使Bax高表達(dá)并轉(zhuǎn)移至線粒體，造成其中凋亡相關(guān)因子的釋放；Caspase 8可啟動(dòng)HEK293細(xì)胞凋亡，但其是否通過線粒體途徑介導(dǎo)凋亡仍有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)揭示了BDE-47對(duì)HEK293細(xì)胞的毒理效應(yīng)，并初步探究了效應(yīng)機(jī)制，為BDE-47的腎細(xì)胞毒理效應(yīng)研究提供了理論支持。

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◆

The Toxicological Effects and Mechanisms of BDE-47 on HEK293 Cells

Cao Lulu1,2, Li Fei1,*, Wu Huifeng1,#, Zhao Jianmin1

1. Key Laboratory of Coastal Environmental Processes and Ecological Remediation of Chinese Academy of Sciences, Yantai Institute of Coastal Zone Research (YIC), Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

5 December 2014 accepted 5 January 2015

Three BDE-47 concentration groups (low: 10-6mol·L-1, medium: 10-5mol·L-1, high: 10-4mol·L-1) and one control group were chosen to investigate the toxic effects of BDE-47 on HEK293 cells, including cell apoptosis ratio and ROS level. Furthermore, the abundance of several proteins (APE1 and p53) and expression level of p53, Bax, Caspase 8 were also detected at molecular level. It was found that cell apoptosis was significantly increased in the medium and high concentration groups (P<0.05) compared with the control. ROS level also increased significantly in the medium concentration group (P<0.01). With the increase of BDE-47 concentrations, the variation trend of APE1 abundance was coincident with that of ROS level. Moreover, the mRNA expression level of apoptosis-related genes (p53, Bax and Caspase 8) was up-regulated with the increase of BDE-47 concentrations. These results showed that BDE-47 could cause several toxic effects on HEK293 cells, including induction of cell apoptosis and oxidative stress. APE1 was perhaps an important mediator of cell apoptosis and oxidative stress. BDE-47 could induce cell apoptosis by affecting the expression of Caspase 8 and p53, Bax through the mitochondria signal pathway.

BDE-47; HEK293; cell apoptosis; oxidative damage; p53; Bax

國(guó)家自然科學(xué)基金(21107136)；國(guó)際科學(xué)基金(F/5230-1); 中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目(KZZD-EW-14); 中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(A類)(XDA11020405)

曹璐璐(1989-)，女，學(xué)士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)毒理，E-mail: llcao1026@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: fli@yic.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141205002

2014-12-05 錄用日期：2015-01-05

1673-5897(2015)2-236-07

X171.5

A

李斐(1982-)，女，工學(xué)博士，助理研究員，主要從事生態(tài)毒理與計(jì)算毒理學(xué)方面的研究。

吳惠豐(1977-)，男，理學(xué)博士，研究員，主要從事海洋生態(tài)毒理方面的研究。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)，E-mail: hfwu@yic.ac.cn

曹璐璐, 李斐, 吳惠豐. BDE-47對(duì)人胚腎細(xì)胞HEK293的毒理效應(yīng)及作用機(jī)制[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(2): 236-242

Cao L L, Li F, Wu H F. The toxicological effects and mechanisms of BDE-47 on HEK293 cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 236-242 (in Chinese)