劉曉靜 汪學(xué)龍

(1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽 六安 237000； 2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

日本血吸蟲(chóng)P7蛋白基因免疫診斷價(jià)值的初步研究*

劉曉靜1汪學(xué)龍2

(1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽 六安 237000； 2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

目的 為了尋找血吸蟲(chóng)病新的免疫學(xué)診斷候選分子，在大腸桿菌中克隆、表達(dá)日本血吸蟲(chóng)(SjP7)蛋白，建立純化重組抗原間接ELISA方法(rSjP7-ELISA)診斷日本血吸蟲(chóng)病。方法 設(shè)計(jì)引物，用PCR法擴(kuò)增出日本血吸蟲(chóng) P7樣蛋白基因編碼基因序列，T載體連接，再將其亞克隆入pET28a(+)表達(dá)載體中，經(jīng)酶切、測(cè)序證實(shí)正確后，用IPTG對(duì)該重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證表達(dá)量和免疫活性。結(jié)果 PCR法擴(kuò)增出一條大小約為423 bp大小的SjP7樣蛋白的DNA片斷，將其克隆亞表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)，測(cè)序證實(shí)具有完整的ORF。結(jié)論 日本血吸蟲(chóng)P7蛋白在血吸蟲(chóng)病免疫診斷上具有較大的應(yīng)用潛能。

日本血吸蟲(chóng)；SjP7蛋白；克隆；免疫診斷

血吸蟲(chóng)病(schitosomiasis)流行于全世界76個(gè)國(guó)家和地區(qū)。目前估計(jì)流行區(qū)約6億人口受威脅，感染人口近2億[1-3]。日本血吸蟲(chóng)主要分布在中國(guó)、日本、菲律賓及印度尼西亞等西太平洋地區(qū)的一些國(guó)家。在我國(guó)僅只有日本血吸蟲(chóng)流行，在我國(guó)長(zhǎng)江流域和長(zhǎng)江以南十三個(gè)省、直轄市、自治區(qū)曾經(jīng)流行嚴(yán)重。日本血吸蟲(chóng)病是由于日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)寄生在人或脊椎動(dòng)物腸系膜靜脈中，所引起的一種人獸共患寄生蟲(chóng)病，其主要的病理特征為蟲(chóng)卵肉芽腫導(dǎo)致的肝纖維化。目前，我國(guó)仍有90多個(gè)縣(市)存在血吸蟲(chóng)病流行，有36萬(wàn)血吸蟲(chóng)病人；存在釘螺的總面積多達(dá)35億m2；且每年都有新病例發(fā)生[4-7]。其中早期、準(zhǔn)確地診斷是重要一環(huán)，故研制特異性高、敏感性強(qiáng)、可以判斷現(xiàn)癥感染和療效的標(biāo)準(zhǔn)化診斷試劑，仍是當(dāng)前血吸蟲(chóng)病研究的重要內(nèi)容。本研究將SjP7基因亞克隆至pET-28a(+)原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組SjP7蛋白，用其作為抗原間接ELISA法免疫診斷血吸蟲(chóng)病，初步探討其在血吸蟲(chóng)病診斷中的使用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 文庫(kù)、菌株和質(zhì)粒 日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)，大腸桿菌DH5α，BL21菌，pET28a(+)表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及來(lái)源 ① 氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG、Tris堿、TaqDNA聚合酶、dNTP、TEMED、β-巰基乙醇等。②PMD-18T克隆載體、限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I、T4DNA連接酶、DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司。③38份血吸蟲(chóng)病患者血清由安徽省血吸蟲(chóng)病防治研究所惠贈(zèng)和本室門(mén)診化驗(yàn)收集。

1.3 方法 ①SjP7基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定。②SjP7基因的PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank登錄號(hào)為EU121231的日本血吸蟲(chóng)SjP7蛋白核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成引物，引物序列如下：P1：5'-CGCGGATCCATGTCAATATCTGAGTCGTTTG-3'，P2：5' -CCGCTCGAGTTATTCAAGAGAGTCTTCAC-3'。兩條引物的5′端分別引入限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。③重組pET28a(+)Sj P7的表達(dá)、純化和鑒定。④重組pET28a(+)Sj P7的小量誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定。將-80℃凍存含重組pET28a(+)Sj P7的BL21大腸桿菌，涂布于LB/kana平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。⑤重組pET28a(+)Sj P7的大量誘導(dǎo)表達(dá)。⑥大腸桿菌細(xì)胞的超聲粉碎。⑦重組pET28a(+)SjP7的純化。⑧重組SjP7應(yīng)用診斷日本血吸蟲(chóng)病間接ELISA法的建立。間接ELISA的具體步驟：包板：用pH 9.6碳酸鹽緩沖液稀釋rSjP7蛋白，每孔100 μl，37℃ 2 h，然后置4℃過(guò)夜；封閉：次日棄去包被液，0.1 mmol/L PBS-T(pH 7.4)洗滌酶標(biāo)反應(yīng)孔3次，每次5 min，扣干。5%封閉液加滿反應(yīng)孔，4℃封閉過(guò)夜；棄封閉液，如上洗滌，每孔加入100 μl用PBS稀釋的人血清樣品，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，37℃溫育2 h；棄血清樣品，如上洗滌，每孔加入100 μl工作濃度的羊抗人IgG-HRP，37℃溫育30 min；棄酶標(biāo)二抗，如上洗滌，每孔加入50 μl TMB顯色底物A和B，37℃避光顯色10 min，然后每孔加入50 μl 2 mol/L H2SO4終止液終止反應(yīng)，30 min內(nèi)于酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)錄入Excel 2003，采用SPS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；各種檢測(cè)方法間，敏感性、特異性和交叉反應(yīng)性百分率的比較采用校正卡方檢驗(yàn)，以α= 0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P≤0.05即為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SjP7樣基因的PCR擴(kuò)增和克隆 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)一條近423 bp的特異條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合。重組PMD-T-SjP7質(zhì)粒和重組pET28a-SjP7質(zhì)粒分別經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后，均可見(jiàn)一條與PCR產(chǎn)物大小一致的DNA片段，以重組pET28a-SjP7為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增亦可獲得一條與cDNA為模板大小一致的PCR產(chǎn)物。

2.2 SjP7樣基因的亞克隆 重組pET28a(+)-SjP7質(zhì)粒分別經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后，可見(jiàn)一條與PCR產(chǎn)物大小一致的DNA片段，以重組pET28a(+)-SjP7質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增亦可獲得一條cDNA為模板大小一致的PCR產(chǎn)物(見(jiàn)圖1)。

圖1 SjP7基因的亞克隆及其PCR擴(kuò)增

1：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：重組pET28a(+)-Sj P7載體的雙酶切產(chǎn)物；3：重組pET28a(+)-Sj P7質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物。

2.3 重組pET28a(+)-SjP7表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE的鑒定 重組pET28a(+)-SjP7可在E.coli BL21高效表達(dá)6-HIS融合蛋白SjP7，在培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，融合蛋白少量以可溶形式表達(dá)，多數(shù)以包涵體形式表達(dá)。SDS-PAGE顯示其分子量約為20 KDa(見(jiàn)圖2)。

圖2 pET28a(+)-SjP7在大腸桿菌BL21中的表達(dá)

1：低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2-3：pET28a(+)-SjP7誘導(dǎo)前上清與沉淀；4-5：pET28a(+)-SjP7誘導(dǎo)后1 h上清與沉淀；6-7：pET28a(+)-SjP7誘導(dǎo)后3 h上清與沉淀；8-9： pET28a(+)-SjP7誘導(dǎo)后5 h上清與沉淀。

2.4 rSjP7-ELISA和SjAWA-ELISA平行檢測(cè)樣本 用兩種方法平行檢測(cè)34份血吸蟲(chóng)病患者血清、8份鉤蟲(chóng)病患者血清和30份正常對(duì)照者血清。結(jié)果如表1所示。

表1 兩種方法檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)病患者及其他人群血清抗體的結(jié)果

注：*經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)兩兩間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

rSjP7-ELISA和SjAWA-ELISA，對(duì)于38份血吸蟲(chóng)病患者血清檢測(cè)的敏感性分別為86.8%和92.1%；26份鉤蟲(chóng)病患者血清抗體的陽(yáng)性率分別為12.5%和25.0%，在40份正常對(duì)照者血清中，rSjP7-ELISA和SjAWA-ELISA均出現(xiàn)1例陽(yáng)性；經(jīng)校正χ2檢驗(yàn)兩兩間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在實(shí)驗(yàn)室中初步證明rSjP7-ELISA法診斷血吸蟲(chóng)病與SjAWA-ELISA法有著相似的敏感性、特異性，表明rSjP7蛋白在血吸蟲(chóng)病免疫診斷上具有較大的應(yīng)用潛能。

目前，國(guó)內(nèi)外多傾向于用基因工程重組抗原進(jìn)行血清學(xué)診斷，以此提高免疫診斷的特異性、敏感性，提高免疫診斷的可重復(fù)性，減少診斷試劑的批間差異。

在已有的報(bào)道中，羅慶禮等[10]將純化的26 kDa rSjGST蛋白通過(guò)間接ELISA檢測(cè)急性血吸蟲(chóng)患者血清中特異性抗體，具有很高的特異性，與糞檢陽(yáng)性的符合率為92.3%。謝可鳴等[11]將日本血吸蟲(chóng)可溶性蟲(chóng)卵抗原(SEA)和重組Sj26(rSj26)抗原分別致敏的硝酸纖維素膜片(NCD)用于膜片免疫酶測(cè)定(D-IEA)，平行檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)病人、衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)病人、華支睪吸蟲(chóng)病人和健康人血清104例的特異性抗體，結(jié)果顯示：分別采用上述兩種抗原檢測(cè)所獲的陽(yáng)性率或假陽(yáng)性率間均無(wú)顯著性差異(P均>0.05)。此結(jié)果均表明以D-IEA檢測(cè)時(shí)顯示高度的敏感性(92.1%～94.7%)和特異性(0～2.9%)，表明rSj26抗原的血清診斷效果與SEA抗原相似，具有實(shí)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)PCR法擴(kuò)增出一條大小約為423 bp大小的SjP7樣蛋白的DNA片斷，將其克隆亞表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)，測(cè)序證實(shí)具有完整的ORF。氨基酸序列顯示其與已知的華支睪吸蟲(chóng)的鋅運(yùn)載蛋白有較高同源性(62%)。

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A preliminary study on the value of P7 protein gene of Schistosoma japonicum immune diagnosis

LIU Xiao-jing1WANG Xue-long2

((1.West Anhui Health Vocational College， Lu'an 237000, China；2. Basic Medical College of Anhui Medical University， Hefei 230032，China)

Objective：To discover new candidate diagnosis molecular for schistosomiasis，the SjP7 protein gene of Schistosoma japonicum were cloned and expressed in E. coli BL21. Indirect ELISA (rSjP7-ELISA) was established for schistosomiasis. Primers were designed and synthesized. Methods：The target gene was amplified from cDNA library by PCR. The product from PCR was cloned into PMD-T vector, and then was subcloned into the expression vector pET28a(+). After induced by IPTG, the cells were collected to analyze by SDS-PAGE and Western blot. Results：For PCR, a specific band of around 423bp was amplified. The gene was subcloned into the expression vector pET28a (+). Conclusion：The rSjP7 has the potential of practical use for the immunodiagnosis of schistosomiasis.

schistosoma japonicum; SjP7 protein; clone; immunodiagnosis

安徽省教育廳2012年度高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(重點(diǎn)，KJ2013A149)。

劉曉靜(1984-)，女，安徽六安人，講師，碩士研究生，研究方向：病原生物學(xué)。

R37

A

1004-7115(2015)03-0241-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.03.001

2014-11-08)