王國(guó)惠，許亞楠

(中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州510275)

?

VOC增溶菌的發(fā)酵培養(yǎng)及增溶作用研究*

王國(guó)惠，許亞楠

(中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州510275)

選擇苯和甲苯作為VOCs代表成分，以增溶活性和乳化率作為指標(biāo)，研究增溶微生物的發(fā)酵條件、BST產(chǎn)生規(guī)律及增溶效果等。結(jié)果表明，成功馴化產(chǎn)BST的增溶微生物。其最適發(fā)酵條件是：碳源質(zhì)量濃度1.0 g/L，初始pH值6.95～7.05，溫度范圍26～32 ℃。增溶菌具有明顯的產(chǎn)BST規(guī)律：在0～36 h內(nèi)持續(xù)快速增加，36 h時(shí)，產(chǎn)生量最大。發(fā)酵液對(duì)苯和甲苯具有良好的增溶效果，分別是純培養(yǎng)基的2.7倍和30倍。苯與BST所形成的乳滴為水包油，易溶于水，有利于VOCs的生物降解。產(chǎn)BST的細(xì)菌大都是G-短桿菌。

VOCs；生物增溶；苯；甲苯

VOCs因排放量大、種類多、毒性強(qiáng)已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。目前已鑒定的VOCs達(dá)300多種，最常見(jiàn)的是苯、甲苯、二甲苯、三氯甲烷等。苯已被世界衛(wèi)生組織列為強(qiáng)致癌物[2]。VOCs處理方法很多，包括冷凝法、吸收法、吸附法和膜分離法、催化燃燒法、等離子體法、光催化氧化法及生物法等[3-8]。目前應(yīng)用較多是吸附法、催化燃燒法和生物法。前兩種方法成本高，給治理企業(yè)帶來(lái)了很大負(fù)擔(dān)。生物法操作簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)二次污染備受青睞[9-12]。然而，由于VOCs水溶性差，導(dǎo)致其可生化性偏低，故限制了該技術(shù)的應(yīng)用[13]。

提高VOCs可生化性的重要途徑就是對(duì)其增溶。表面活性劑對(duì)VOCs具有良好的增溶作用。利用表面活性劑提高疏水性有機(jī)污染物的溶解性已有展開(kāi)，但大多利用的是化學(xué)表面活性劑。而化學(xué)表面活性劑具有毒性且難降解，易引起二次污染。生物表面活性劑(簡(jiǎn)稱BST)不僅具有良好的表面活性和乳化性能[14]，且具無(wú)毒、易于生物降解等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其在VOCs生物治理方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究針對(duì)VOCs水溶性差影響其生物降解問(wèn)題，馴化VOCs增溶微生物，使其產(chǎn)BST。利用BST使VOCs增溶。本研究選擇苯和甲苯作為VOC的代表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

為了滿足實(shí)際工程的需要，直接用發(fā)酵液對(duì)VOC進(jìn)行增溶，不僅降低生產(chǎn)成本，且發(fā)酵液完成增溶后還將為下一步降解微生物帶來(lái)營(yíng)養(yǎng)。本研究建立一個(gè)完全開(kāi)放式的自然發(fā)酵體系，可為BST的大批量生產(chǎn)提供技術(shù)支持。通過(guò)本研究，有望突破VOC因難溶于水而影響其生物降解這一瓶頸，為VOCs的高效生物處理提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

搖床(SUKUN SKY-211，上海蘇坤)、干燥箱(DHG-9240A，上海申賢)、電子天平(FA2204，上海安亭)、滅菌器(LS-B50L)、培養(yǎng)箱(SGSP-02 黃石恒豐)、超凈臺(tái)(SW-CJ-1D，蘇州凈化)、水浴鍋(HH-4)、離心機(jī)(TDZ5-WS，長(zhǎng)沙平凡)、pH計(jì)(DELTA 320)、氣泵、流量計(jì)及液相色譜儀(日本島津)等。

1.2 主要試劑

苯(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、甲苯(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、蘇丹紅Ⅲ((分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、甲醇(色譜純，廣州化學(xué)試劑廠)。

1.3 培養(yǎng)基

硫酸銨5 g/L ，廢石油20 g/L，葡萄糖1.0 g/L，氯化鉀1.0 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，pH 7～7.5，自來(lái)水1 L。

1.4 種源樣品

樣品來(lái)自某污水處理池。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 增溶菌的馴化

2.1.1 搖床馴化 在無(wú)菌條件下，于500 mL三角瓶中加入200 mL滅菌培養(yǎng)基，污泥按一定比例接入，搖床馴化。

2.1.2 擴(kuò)大培養(yǎng) 于2.5 L用紗布封口的廣口瓶中加入1.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基，高壓滅菌。在無(wú)菌條件下，按一定比例轉(zhuǎn)接馴化種液，曝氣培養(yǎng)。按同樣方法，進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接。逐漸由無(wú)菌接種變?yōu)樽匀唤臃N，再過(guò)渡到完全開(kāi)放式自然培養(yǎng)。設(shè)對(duì)照組。

2.2 增溶活性指標(biāo)及測(cè)定方法

實(shí)驗(yàn)時(shí)先用液態(tài)苯及液態(tài)甲苯進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2.1 增溶能力及測(cè)定方法 取一直徑為9 cm平皿，加入20 mL去離子水，然后在水面上緩慢滴加2 mL染色苯或染色甲苯，待形成穩(wěn)定薄膜后，在薄膜中心滴加1 mL離心后的發(fā)酵液。發(fā)酵液若能增加苯或染色甲苯在水中的“溶解”，便形成一圓圈，即增溶圈。測(cè)量增溶圈直徑。每組設(shè)3個(gè)平行，取其平均值。染色苯和染色甲苯是苯和甲苯分別用蘇丹紅Ⅲ染色而成的。

2.2.2 乳化能力及測(cè)定方法 苯或甲苯與發(fā)酵液按一定比例作用，若發(fā)酵液中有BST的產(chǎn)生，則二者即可形成乳化層。乳化能力以乳化百分率(EI)衡量。乳化百分率的計(jì)算

其中，Hem為乳化層高度，cm；Hoi為苯層高度，cm。

2.3 乳化液乳化性質(zhì)的鑒別

乳狀液兩類型[15]：一類是水包油型(O/W)；另一類是油包水型(W/O)。為了提高鑒別的準(zhǔn)確性，分別用親油性染料(蘇丹紅Ⅲ)和親水性染料(沙黃和結(jié)晶紫)對(duì)乳狀液進(jìn)行染色。用蘇丹紅Ⅲ染色的乳狀液若整體為紅色，則為W/O型；若僅乳滴為紅色，則為W/O型。用沙黃或結(jié)晶紫染色的乳狀液若整體為紅色或紫色，則為O/W型；若僅乳滴為紅色或紫色，則為W/O型。

2.4 增溶實(shí)驗(yàn)

2.4.1 增溶實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由氣泵、吸收瓶、氣體混合瓶、流量計(jì)及增溶瓶等通過(guò)膠管連接而成。增溶瓶有兩個(gè)。一個(gè)裝發(fā)酵液，為增溶實(shí)驗(yàn)瓶；另一個(gè)裝空白培養(yǎng)基，為對(duì)照瓶。

實(shí)驗(yàn)所用苯及甲苯為氣態(tài)苯及甲苯。氣態(tài)苯及甲苯采用吹脫法配制。氣泵將空氣分別鼓入裝有液態(tài)二苯的吸收瓶和氣體混合瓶。通入吸收瓶中的空氣將氣態(tài)二苯載入混合瓶，與空氣按一定比例充分混合后分別被送入增溶瓶和對(duì)照瓶中?；旌蠚怏w的流量由流量計(jì)控制，保證通入增溶瓶的流量(16 L/h)相等。連續(xù)6 h后停止通氣，靜止6 h，共持續(xù)12 h，取樣，每1 h取樣一次。

2.4.2 增溶率的測(cè)定 增溶率的測(cè)定采用高效液相色譜法測(cè)定“溶解”態(tài)苯的濃度。具體方法如下：

(1)色譜條件。流動(dòng)相甲醇水溶液，配比為V(甲醇)/V(水)=80/20，檢測(cè)器SPD-20AV、色譜柱SHIMADZU VP-ODS C18、流速0.8 mL/min、柱溫40 ℃、檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

(2)增溶率(IS)的計(jì)算。增溶率(IS)為苯及甲苯在發(fā)酵液中的最大“溶解度”(Sf)與苯及甲苯在空白發(fā)酵培養(yǎng)基中的“溶解度”(Sc)之差與Sc的比值，為無(wú)量綱量。氣態(tài)苯與甲苯增溶率的計(jì)算公式為

其中，Sf與Sc的單位為g/L。

實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的溶解度為氣態(tài)苯及甲苯的表觀溶解度。因此，用表觀溶解度計(jì)算所得到的增溶率為表觀增溶率。實(shí)驗(yàn)中用表觀增溶率來(lái)衡量發(fā)酵液中BST對(duì)氣態(tài)苯的增溶效果。

通氣過(guò)程中定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液對(duì)氣態(tài)苯及甲苯的“溶解量”及停止通氣后發(fā)酵液中苯及甲苯的溶解量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以發(fā)酵液中“溶解”態(tài)苯及甲苯的含量為縱坐標(biāo)，繪制溶解量隨時(shí)間的變化曲線，確定發(fā)酵液對(duì)苯與甲苯的增溶穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與分析

3.1 搖床馴化結(jié)果

3.1.1 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)馴化效果的影響 設(shè)葡萄糖質(zhì)量濃度為0、 0.5、1.5和2.0 g/L，其他條件不變，通過(guò)增溶能力和乳化能力，確定最佳葡萄糖質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 碳源濃度對(duì)馴化效果的影響Fig.1 Effect of concentration of carbon source on acclimation effect

由圖1可知，當(dāng)ρ(葡萄糖)為0 g/L時(shí)，增溶直徑和乳化率都為0，說(shuō)明發(fā)酵液沒(méi)有BST的產(chǎn)生。當(dāng)ρ(葡萄糖)分別為0.5、1.5和2.0 g/L時(shí)，發(fā)酵液都有BST的產(chǎn)生，但含量都偏低。當(dāng)ρ(葡萄糖)為1.0 g/L時(shí)，增溶直徑和乳化率都最大，即發(fā)酵液中BST含量最高。因此，發(fā)酵液最佳葡萄糖質(zhì)量濃度確定為1.0 g/L。

以上結(jié)果表明，BST的產(chǎn)生需要一定糖類物質(zhì)。廢石油是碳源，但不是唯一碳源，還需糖類碳源的幫助。廢石油起到的可能是刺激或誘導(dǎo)作用，在被微生物利用的同時(shí)，刺激其產(chǎn)BST。

3.1.3 初始pH值對(duì)馴化效果的影響 取葡萄糖質(zhì)量濃度為1.0 g/L，將初始pH值設(shè)為6.65、6.75、6.85、6.95、7.05、7.15、7.25和7.35，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液的增溶能力和乳化能力，確定最佳初始pH。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 初始pH值對(duì)馴化效果的影響Fig.2 Effect of different initial pH on acclimation effect

由圖2可知，初始pH值在6.95～7.05之間時(shí)，發(fā)酵液的增溶直徑和乳化率都相對(duì)比較高。高于或低于此范圍，增溶直徑和乳化率都將減小。由此確定，發(fā)酵最佳初始pH值在6.95～7.05之間。

3.1.3 溫度對(duì)馴化效果的影響 在最適碳源濃度、最適初始pH值條件下，將搖床溫度分別設(shè)20、22、24、26、28、30、32、34和36 ℃，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液的增溶能力和乳化能力，確定其最佳馴化溫度。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)馴化效果的影響Fig.3 Effect of temperature on acclimation effect

由3可知，馴化溫度在26～32 ℃時(shí)，BST釋放量最大，高于或低于此范圍，增溶直徑和乳化率都將減小。故確定發(fā)酵最佳溫度范圍為26～32 ℃。

3.2 擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)果

3.2.1 BST產(chǎn)生規(guī)律 通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液對(duì)苯和甲苯的增溶活性，得到BST產(chǎn)生隨時(shí)間的變化規(guī)律(圖4)。

圖4 BST產(chǎn)生曲線Fig.4 Release curves of BST

由圖4可見(jiàn)，接種12 h內(nèi)，發(fā)酵液對(duì)苯和甲苯的增溶活性明顯增加。這說(shuō)明增溶菌對(duì)新環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。自接種至36 h，發(fā)酵液對(duì)兩種苯的增溶與乳化一直呈快速增加的趨勢(shì)，36 h后緩慢下降。BST產(chǎn)生規(guī)律的研究對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義，可依據(jù)該規(guī)律，確定發(fā)酵周期。

3.2.2 發(fā)酵液增溶效果

(1)發(fā)酵液對(duì)苯的增溶效果。通過(guò)前面的實(shí)驗(yàn)，已證明BST對(duì)液態(tài)苯及甲苯有優(yōu)良的增溶及乳化能力，但實(shí)際生產(chǎn)時(shí)，被處理的VOCs成分為氣態(tài)形式。為了進(jìn)一步證明BST對(duì)VOCs的增溶作用，即提高氣態(tài)苯類在水相中的“溶解度”，對(duì)其進(jìn)行了增溶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 氣態(tài)苯增溶曲線Fig.5 Solubilization curves of gaseous benzene

由圖5可知，連續(xù)通氣1 h后，苯在發(fā)酵液中的“溶解”量約為1.67 g/L；苯在空白培養(yǎng)基的質(zhì)量濃度只有0.7 g/L。此后繼續(xù)通氣，兩種溶液中苯的含量都在增加。通氣4～6 h，發(fā)酵液中苯的質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，達(dá) 2.0 g/L。6 h后停止通氣時(shí)，空白培養(yǎng)基中苯的質(zhì)量濃度僅為0.9 g/L，而發(fā)酵液中苯的質(zhì)量濃度一直在1.8 g/L以上。在隨后的6 h中，空白培養(yǎng)基中的苯一直在減少，平均揮發(fā)速率約為0.064 g·L-1·h-1，而發(fā)酵液中苯的質(zhì)量濃度維持在約2 g/L。

由此可見(jiàn)，在通氣過(guò)程中，發(fā)酵液對(duì)苯有明顯的“溶解”效果，且較穩(wěn)定。發(fā)酵液的表觀溶解度達(dá)空白培養(yǎng)基的2.7倍?？梢?jiàn)BST對(duì)氣態(tài)苯具有良好而穩(wěn)定的增溶效果。

(2)發(fā)酵液對(duì)甲苯的增溶效果(圖6)。從圖6可見(jiàn)，甲苯在純培養(yǎng)基中的表觀溶解度只有0.004 7～0.007 0 g/L。但在發(fā)酵液中，甲苯的質(zhì)量濃度在通氣開(kāi)始時(shí)為0.11 g/L，表觀增溶量是空白培養(yǎng)基的9倍。隨著甲苯氣體的持續(xù)通入，其在發(fā)酵液中的量不斷增加。通氣0～3 h時(shí)，發(fā)酵液對(duì)甲苯的表觀增溶率達(dá)空白培養(yǎng)液的27倍。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，空白培養(yǎng)基中的甲苯持續(xù)揮發(fā)，發(fā)酵液中甲苯含量比較穩(wěn)定，說(shuō)明BST能與甲苯穩(wěn)定地結(jié)合在一起。在12 h時(shí)，發(fā)酵液的表觀增溶量為空白培養(yǎng)基的30倍?？梢?jiàn)發(fā)酵液對(duì)氣態(tài)甲苯也具有理想的增溶效果。

圖6 氣態(tài)甲苯增溶曲線Fig.6 Solubilization curves of gaseous toluene

3.3 乳化類型鑒定

發(fā)酵液與苯和甲苯的乳化類型鑒定結(jié)果是：用蘇丹紅Ⅲ染色時(shí)，整體未被染色，染料與分散相不能互溶,而乳滴被染為紅色。初步判定乳化層為O/W型。用沙黃和結(jié)晶紫染色時(shí)，整體分別被染成了紅色和紫色，進(jìn)一步證明乳化層為O/W型。

水包油的“殼”外層親水，故可與水相混。本實(shí)驗(yàn)中苯與BST所形成的乳滴為水包油，故易溶于水。這對(duì)苯類及其VOCs的生物降解是極為有利的。

3.4 增溶菌的初步鑒定結(jié)果

出于生產(chǎn)應(yīng)用的考慮，本研究所馴化的增溶菌非單一純種。通過(guò)革蘭氏染色與顯微觀察，大都為革蘭氏陰性短桿菌。相關(guān)內(nèi)容將進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

成功馴化獲得了產(chǎn)BST的微生物，確定了產(chǎn)BST的最適條件。BST具有明顯的產(chǎn)生規(guī)律，約 36 h時(shí)產(chǎn)生量最大。馴化所得到的BST對(duì)苯與甲苯都具有良好的增溶效果，發(fā)酵液對(duì)苯的表觀“溶解度”為空白培養(yǎng)基的2.7倍。在12 h時(shí)，發(fā)酵液對(duì)甲苯的表觀增溶量為空白培養(yǎng)基的30倍。苯和甲苯與BST所形成的乳滴為水包油，易溶于水，這有利于苯類及其VOCs的生物降解。產(chǎn)BST的細(xì)菌大都是G-短桿菌。

[1] 曲茉莉. 大氣中VOCs的污染現(xiàn)狀及治理技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境科學(xué)與管理，2012, 37(6)：102-104．

[2] LEBRERO R, ESTRADA J M, MUOZETAL R. Deterioration of organic packing materials commonly used in air biofiltration: Effect of VOC-packing interactions[J]. Journal of Environmental Management，2014,92(1)：93-100.

[3] 楊平平. 碳纖維工業(yè)廢氣的處理技術(shù)[J]. 山西冶金，2011,34(6)：4-6,12.

[4] 王治民，孫建薇. 關(guān)于VOC廢氣處理技術(shù)的相關(guān)思考[J]. 能源與節(jié)能，2014(5)：97-99.

[5] JOACHIM H, ANTHONY M B. Thermal plasma waste treatment[J]. Journal of Physics D: Applied Physics，2008，41(5)：53001.

[6] SHAHIDI S, GHORANNEVISS M. Sterilization of cotton fabrics using plasma treatment[J]. Plasma Sci Technol，2013,15(10)：1031-1033.

[7] KUBO W, TATSUMA T. Mechanisms of photocatalytic remote oxidation[J]. Journal of the American Chemical Society，2006，128(50)：16034-16035.

[8] MAITRA U, NAIDU B S, GOVINDARAJ A, et al. Importance of trivalency and the e(g)(1) configuration in the photocatalytic oxidation of water by Mn and Co oxides[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110(29)：11704-11707.

[10] HENKEL M, MüLLER M M, KüGLER J H, et al. Rhamnolipids as biosurfactants from renewable resources:concepts for next-generation rhamnolipid production [J]. Process Biochemistry, 2012,47 (8): 1207-1219.

[11] WADEKAR S, KALE S, LALI A,et al. Sophorolipid production by starmerella bombicola (ATCC 22214) from virgin and waste frying oils, and the effects of activated earth treatment of the waste oils [J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2012, 89 (6): 1029-1039.

[12] BARTACEK J, KENNES C, LENS P N L. Biotechniques for air pollution control (biotechniques 2009)[J]. Reviews in Environmental Science and Biotechnology，2009，8(4)：321-323.

[13] 劉佳，楊竹慧，李堅(jiān). BST在疏水性VOCs生物降解中的應(yīng)用潛力[J]. 中國(guó)科技論文，2014,9(3)：355-359.

[14] 趙東維. BST產(chǎn)生菌對(duì)石油的降解及對(duì)石油烴的增溶作用研究[D]. 青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2013.

[15] 王霞，潘成松，陳軍,等. O/W型稠油乳狀液的靜態(tài)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)[J]. 鉆采工藝，2009,32(6)：46-48.

The Fermentation Culture of VOCs Solubilization Microorganisms and Its Solubilization

WANGGuohui，XUYanan

(School of Enviromental Sciences and Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275,China)

To improve the water-solubility and biodegradability of VOCs, VOCs solubilization microorganisms were domesticated to make its produce biosurfactant to make VOC solubilize. Benzene and toluene were selected as representative composition,such as solubilization activity and emulsifying rate as index, the fermentation conditions, production regularity and solubilization effect of microorganisms of VOCs solubilization etc were studied. The result showed that the solubilization microorganisms that produce BST were successfully domesticated. The optimum fermentation conditions for the production of BST was that the best carbon source concentration was 1.0 g/L and the optimal initial pH value was in the range of 6.95～7.05 and the optimum temperature range was in the range of 26～32 ℃. The solubilization bacteria had an obvious regularity for production of BST. The BST continue to increased rapidly during the fermentation of 0～36 h, and arrived at a maximum yield at 36 h. The fermentation liquid had good effect on the solubilization of benzene and xylene. The fermentation liquid had good effect on the solubilization of benzene and xylene. They were 2.7 times and 30 times of the pure medium, respectively. The emulsion droplets formed by benzene and BST were as an oil in water and it is soluble in water. This was more favorable for the biodegradation of VOCs. The bacteria producing BST were mostly gram negative bacilli. The BST was initially identified as a polysaccharide. The content of BST in the fermentation broth was about 60 g/L.

VOCs; biosolubilization; benzene; toluene

10.13471/j.cnki.acta.snus.2015.05.017

2015-07-20

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013B020600005)；廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合資助項(xiàng)目(2012B091100318)；廣州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014J4100093)；廣州市2013年污染防治新技術(shù)、新工藝開(kāi)發(fā)資助項(xiàng)目

王國(guó)惠(1962年生)，女；研究方向：廢氣生物治理;E-mail:1761424972@qq.com

X512

A

0529-6579(2015)05-0085-05