羅 斌， 王麗娜， 晚亞雄， 石艷榮， 牛靜萍， 羅小峰

(蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生研究所， 蘭州 730000)

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低溫條件下大氣PM2.5對(duì)大鼠心臟抗氧化能力及炎癥反應(yīng)的影響*

羅 斌△， 王麗娜， 晚亞雄， 石艷榮， 牛靜萍， 羅小峰

(蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生研究所， 蘭州 730000)

目的：探討不同低溫條件下大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)對(duì)大鼠心臟抗氧化能力及炎癥反應(yīng)的影響。方法：將36只健康雄性Wistar大鼠按體重隨機(jī)分成6組(n=6)，分別給予0℃、10℃及20℃(常溫對(duì)照)的單純低溫刺激及低溫+PM2.5暴露。低溫+PM2.5暴露組給予低溫刺激及氣管滴注PM2.5(每次0.25 ml/8 mg)，單純低溫刺激組和常溫組給予無(wú)菌生理鹽每只每次0.25 ml，間隔48 h，連續(xù)3次。末次染毒48 h后處死大鼠，采用試劑盒法測(cè)定心肌組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)及C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平。結(jié)果：低溫+PM2.5暴露組大鼠心肌組織中MDA、SOD、IL-6及CRP水平顯著高于單純低溫組，尤其在0℃時(shí)，PM2.5對(duì)四指標(biāo)的影響最為顯著(P<0.05)。各單純氣溫組間比較時(shí)，僅SOD在0℃組降低較為明顯，其余指標(biāo)未出現(xiàn)顯著變化。各低溫PM2.5暴露組組間比較時(shí)，MDA、SOD、IL-6及CRP在0℃的PM2.5暴露組升高最為明顯，顯著高于其他各組(P<0.05)。交互作用檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)低溫和PM2.5間存在顯著交互作用(P<0.05)。結(jié)論：低溫刺激可能會(huì)增加PM2.5的心臟毒性，使其抑制心肌組織抗氧化能力和促進(jìn)炎癥的發(fā)生增加。

低溫；大氣PM2.5；大鼠心肌組織；抗氧化能力；炎癥反應(yīng)

cold stress； fine particulate matter； rat myocardial tissue； anti-oxidative capacity； inflammatory response

流行病學(xué)研究認(rèn)為急性或長(zhǎng)期暴露于大氣顆粒物能引起心血管疾病發(fā)病和死亡率的急劇增加[1, 2]。這種增加的機(jī)制可能為顆粒物暴露引起心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷和炎癥等有關(guān)，通過(guò)抑制心肌組織抗氧化能力和增加氧化自由基的產(chǎn)生，并引起炎癥因子水平的升高，從而誘發(fā)心血管疾病[3, 4]。低溫作為心血管系統(tǒng)的又一危險(xiǎn)因素，它與心血管疾病的增加呈負(fù)相關(guān)，氣溫越低心血管疾病危險(xiǎn)性越大[5]。據(jù)報(bào)道低溫及大氣顆粒物在對(duì)心血管系統(tǒng)的影響中存在交互作用，低溫能增強(qiáng)PM2.5對(duì)心血管系統(tǒng)的毒性作用，造成心血管疾病發(fā)病率和死亡率的升高[6]。由此可見，低溫刺激下PM2.5的心血管系統(tǒng)毒性可能增強(qiáng)。環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，冷空氣擾動(dòng)發(fā)生時(shí)會(huì)引起大氣PM2.5濃度升高。如發(fā)生于蘭州2014年4月的一次冷空氣過(guò)程，48 h最低溫下降了5℃，最低溫達(dá)2℃，同時(shí)該日蘭州地區(qū)大氣PM2.5濃度高達(dá)616 μg/m3。因此，低溫刺激下較高濃度的PM2.5暴露是否對(duì)心血管系統(tǒng)的影響更大是需要迫切解決的問(wèn)題。本研究將利用低溫刺激與大氣PM2.5對(duì)大鼠進(jìn)行聯(lián)合暴露，并從心肌抗氧化能力及炎癥反應(yīng)的角度來(lái)探討不同低溫條件下PM2.5對(duì)大鼠的心臟毒性。

1 材料與方法

1.1 PM2.5采集和處理

利用PM2.5采樣儀采集蘭州地區(qū)2014年4～5月大氣PM2.5，離地5 m以100 L/min流量連續(xù)采集于玻璃纖維濾膜上，剪成1 cm2大小的小塊，置于去離子水中超聲震蕩20 min，重復(fù)3次，功率500 W洗脫顆粒物。6層紗布過(guò)濾，除去玻璃纖維濾膜。將濾過(guò)液于4℃，12 000 r/min，離心20 min，收集下層沉淀液，真空冷凍干燥，于-20℃避光保存。染毒前，利用生理鹽水(normal saline，NS)將PM2.5制成懸液，超聲振蕩15 min, 使懸液混勻并高壓滅菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

36只健康雄性Wistar大鼠購(gòu)買于甘肅省中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK (甘) 2004～0006，體重(209.41±16.33) g。將36只大鼠按體重隨機(jī)分成6組(n=6)，于室溫(20±1)℃、相對(duì)濕度40%～60%，空白對(duì)照飼養(yǎng)7 d，期間給予充足的水和飼料。6組分別為常溫組(20℃)、常溫PM2.5染毒組(20℃+PM2.5)、低溫刺激組Ⅰ(10℃)，低溫刺激組Ⅱ(0℃)、低溫刺激Ⅰ+PM2.5染毒組(10℃+PM2.5)、低溫刺激Ⅱ+PM2.5染毒組(0℃+PM2.5)

1.3 低溫刺激及PM2.5染毒

適應(yīng)性飼養(yǎng)后，6組大鼠隨機(jī)接受不同的處理因素。具體暴露過(guò)程為：將大鼠放于氣象環(huán)境模擬箱中，給予低溫刺激4 h(氣壓及相對(duì)濕度同空白對(duì)照)，期間第2小時(shí)乙醚麻醉大鼠，并通過(guò)氣管滴注給予PM2.5組無(wú)菌PM2.5懸液(預(yù)降溫，每次8 mg/0.25 ml)染毒，而給予單純低溫組無(wú)菌NS每只每次0.25 ml，間隔48 h，連續(xù)染毒3次。

1.4 心肌組織勻漿制備及指標(biāo)測(cè)定

末次低溫刺激和PM2.5暴露48 h后，腹腔注射水合氯醛(5%，0.6 ml/kg)，通過(guò)腹主動(dòng)脈終末采血法處死大鼠，立即摘取心臟并稱重，按照1∶9生理鹽水利用勻漿器在冰浴中將其制成10%組織勻漿，4℃ 3 000 r/min離心20 min，取上清液分裝成5管，保存于-80℃，分別用于測(cè)定組織勻漿中總蛋白、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malonaldehyde，MDA)(南京建成生物工程研究所)，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)(RD Systems，Inc)。具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織抗氧化能力的變化

MDA在0℃及10℃的PM2.5暴露組均顯著高于相應(yīng)單純低溫刺激暴露組(P<0.05)，而且在0℃的PM2.5暴露組顯著高于常溫PM2.5組(P<0.05)。MDA在各單純氣溫刺激組間并無(wú)顯著差異。在SOD的結(jié)果中，0℃的PM2.5暴露組明顯低于相應(yīng)單純低溫刺激組及其他PM2.5暴露組(P<0.05)，而且在0℃單純低溫刺激組也明顯低于常溫對(duì)照組(P<0.05，表1)。盡管交互作用檢驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的交互作用，但這些結(jié)果可能提示PM2.5暴露在低溫時(shí)對(duì)大鼠心臟抗氧化能力影響更強(qiáng)。

Tab. 1 SOD and MDA level of myocardial tissue in cold stress alone groups and cold stress combined PM2.5 exposure groups

GroupsSOD(mgprot/ml)MDA(nmol/mgprot)20℃+saline2547.46±460.670.88±0.2120℃+PM2.52338.38±256.011.00±0.1010℃+saline2328.98±253.860.94±0.1110℃+PM2.52250.16±534.381.21±0.26*0℃+saline1991.52±273.52#1.06±0.09#0℃+PM2.51676.65±130.11*Δ1.29±0.28*Δ

SOD： Superoxide dismutase; MDA： Malondialdehyde

*P<0.05vscorresponding cold stress alone group；#P<0.05vsgroup of 20℃+saline；ΔP<0.05vsgroup of 20℃+PM2.5

2.2 各組大鼠心肌組織炎癥因子CRP和IL-6的影響的變化

IL-6及CRP在0℃的PM2.5暴露組濃度最高，顯著高于常溫20℃PM2.5暴露組(P<0.05)，并且高于相應(yīng)單純低溫刺激組(P<0.05)，各單純低溫刺激組間并無(wú)顯著差異。在10℃組及常溫組，CRP在PM2.5暴露組顯著高于相應(yīng)單純低溫刺激組(P<0.05)。盡管交互作用檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)顯著的交互作用，但上述結(jié)果提示PM2.5暴露在低溫時(shí)對(duì)大鼠心臟炎癥因子影響更大。

Tab. 2 IL-6 and CRP level of myocardial tissue in cold stress alone groups and cold stress combined PM2.5 exposure groups

GroupsIL-6(pg/ml)CRP(pg/ml)20℃+Sa-line16.25±1.46251.37±11.4320℃+PM2.517.25±0.83261.45±4.23*10℃+Sa-line16.19±0.96246.69±10.2210℃+PM2.516.9±2.35261.18±16.86*0℃+Saline17.53±1.16248.22±11.650℃+PM2.518.98±1.28*#285.46±18.76*#

IL-6: Interleukin-6； CRP: C-reactive protein

*P<0.05vscorresponding cold stress alone group；#P<0.05vsgroup of 20℃+PM2.5

3 討論

MDA含量的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，而SOD可以清除機(jī)體內(nèi)的自由基如O2、H2O2，缺乏或耗竭SOD會(huì)促使許多有毒化學(xué)物質(zhì)或不良環(huán)境因素對(duì)機(jī)體產(chǎn)生中毒作用或加重其中毒作用。因此,心肌組織中MDA和SOD的含量是衡量心肌組織氧化損傷和抗氧化能力大小的重要指標(biāo)。IL-6與CRP作為典型的炎癥因子，能反映機(jī)體炎癥的發(fā)生情況。趙金鐲等發(fā)現(xiàn)PM2.5能夠引起WKY及SHR大鼠心肌組織中CRP及IL-6等炎癥因子水平的升高，并引起心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活性下降及MDA的升高[7]。這與本研究的結(jié)果相似。本研究結(jié)果提示PM2.5暴露組大鼠心肌組織中MDA和SOD含量分別高于和低于非PM2.5暴露組，而且IL-6和CRP也顯著高于非PM2.5暴露組，說(shuō)明急性PM2.5暴露不僅引起大鼠心肌組織氧化損傷和抗氧化功能的抑制，而且還引起了心臟的炎癥反應(yīng)。低溫引起心血管疾病事件的發(fā)生增加，尤其是冷空氣過(guò)程會(huì)造成心血管疾病發(fā)生率和死亡率的急劇升高[8]。以往研究發(fā)現(xiàn)冷空氣過(guò)程可能通過(guò)升高血壓及其他危險(xiǎn)因子如血壓、血脂、血纖維蛋白原等來(lái)增加心血管疾病危險(xiǎn)[9, 10]。本研究中，低溫刺激除引起心肌組織SOD顯著的降低外，其他指標(biāo)并未出現(xiàn)明顯變化。因此，可以認(rèn)為低溫刺激還可能會(huì)通過(guò)降低心肌的抗氧化能力來(lái)增加心血管疾病危險(xiǎn)性。

研究認(rèn)為低溫能夠增加PM2.5對(duì)心血管疾病的影響，引起心血管疾病發(fā)生和死亡的增加，但其機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用低溫刺激與PM2.5進(jìn)行聯(lián)合毒理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示低溫(0℃)時(shí)，PM2.5對(duì)大鼠心肌組織SOD、MDA、IL-6及CRP影響顯著。盡管交互作用檢驗(yàn)并不顯著，但該結(jié)果提示較低氣溫刺激可能會(huì)增加PM2.5對(duì)心血管系統(tǒng)的影響，并通過(guò)增加PM2.5暴露對(duì)心肌組織抗氧化能力的抑制和促進(jìn)炎癥的發(fā)生而發(fā)生。PM2.5主要通過(guò)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)，粒徑較小的顆粒甚至通過(guò)肺泡毛細(xì)血管進(jìn)入心臟中，從而對(duì)心臟產(chǎn)生毒性作用[11]。低溫刺激可能會(huì)抑制呼吸系統(tǒng)對(duì)PM2.5的防御，如低溫刺激可以破壞氣道纖毛結(jié)構(gòu)[12]，并降低肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬能力[13]。因此低溫刺激可以抑制氣道纖毛對(duì)PM2.5的清除及肺巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞對(duì)PM2.5的吞噬作用，從而使得進(jìn)入體內(nèi)的PM2.5增加。此外，低溫刺激還能引起心臟的其他毒性作用，如引起抗氧化能力下降，心血管疾病危險(xiǎn)因子增加，從而加重PM2.5對(duì)心臟的毒性作用[9, 14]。

綜上所述，低溫刺激可能會(huì)增加PM2.5的心臟毒性，使其抑制心肌組織抗氧化能力和促進(jìn)炎癥的發(fā)生增加。

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2014-09-23 【修回日期】2014-11-07

R122

A

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