李良昌，樸紅梅，延光海，秦向征，李光昭

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室, 吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科, 吉林 延吉 133000)

芝麻素抗哮喘炎癥作用研究

李良昌1，樸紅梅2，延光海1，秦向征1，李光昭1

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室, 吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科, 吉林 延吉 133000)

目的 觀察芝麻素抗哮喘作用，并探討其可能的作用機制。方法 40只♂清潔級BALB/c小鼠，隨機分為正常組、哮喘組、芝麻素低劑量組、芝麻素高劑量組和地塞米松組。體外卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)建立哮喘模型，ELISA和Western blot方法檢測芝麻素對支氣管炎肺泡灌洗液(BALF)和肺組織白細胞介素- 4、5、13(IL-4、5、13)、干擾素-γ(IFN-γ)表達的影響。HE染色觀察肺部炎癥變化，Western blot方法檢測IκBα磷酸化和NF-κB活化。結(jié)果 哮喘組與正常組相比，炎癥細胞計數(shù)、IL-4、IL-5、IL-13水平增高，而IFN-γ的表達明顯降低(P<0.05)，IκBα磷酸化和NF-κB核轉(zhuǎn)位明顯增加(P<0.05)；芝麻素高劑量組明顯降低炎癥細胞計數(shù)、IL-4、IL-5、IL-13水平，提高IFN-γ的表達(P<0.05)，同時抑制IκBα磷酸化和NF-κB核轉(zhuǎn)位(P<0.05)。結(jié)論 芝麻素通過抑制NF-κB激活，減輕哮喘炎癥反應(yīng)。

哮喘；芝麻素；氣道炎癥；NF-κB；白介素4；白介素5；干擾素-γ

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞等多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病[1]。糖皮質(zhì)激素是治療哮喘的一線藥物，但長期使用可引起耐藥性和嚴(yán)重的副反應(yīng)。因此，有必要研究哮喘的發(fā)病機制，尋求新的治療哮喘的靶點。芝麻素從芝麻中提取，在體內(nèi)表現(xiàn)出較強的生物學(xué)活性，其藥物作用近年逐漸被人們所重視。研究表明，芝麻素通過抑制p38磷酸化和NF-κB激活，抑制IL-6釋放[2]，通過p38和JNK信號途徑降低MMP-1，3和13的表達[3]，也可以通過降低VCAM-1表達抑制白細胞遷移，改善器官炎癥[4]，對血管內(nèi)皮有明顯的保護作用[5]，表明芝麻素有明顯的抗炎作用，但芝麻素抗哮喘作用研究卻未見報道。本研究利用哮喘動物模型觀察芝麻素抗哮喘作用，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑卵清蛋白 (OVA)、氫氧化鋁購自美國Sigma公司；細胞因子 IL-4、IL-5、IL-13 和 IFN-γ 檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司;IL-4、IL-5、IL-13 和IFN-γ多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；IκBα、NF-κB p65 和β-actin購自美國Cell Signaling公司。霧化器(上海四菱醫(yī)療器械廠402型超聲霧化器)；酶聯(lián)免疫檢測儀 (RT-2100C，美國)；電泳儀及電泳槽 (E-C Apparatus Corporation，美國)；Western blot轉(zhuǎn)膜儀和Gel Doc凝膠成像儀(BioRad公司)。

1.2 哮喘模型的建立和動物分組♂ BALB/c 小鼠 40只，體質(zhì)量(18±5)g，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(吉)2003-000。小鼠隨機分成5組，每組 8 只。正常組(Normal)、哮喘組(OVA)、芝麻素低、高劑量組(Sesamin 50、100 mg·kg-1)、陽性對照地塞米松組(DXM)。除正常組外，其余各組分別于d 1、d 14給小鼠腹腔注射2% OVA和氫氧化鋁混合溶液 0.2 mL致敏。d 21將致敏小鼠置于玻璃罩內(nèi)，以1% 生理鹽水 OVA 溶液15 mL霧化激發(fā) 30 min，每天1次，共 5 d。芝麻素低、高劑量組分別在激發(fā)前灌服芝麻素50、100 mg·kg-1，地塞米松組按0.5 mg·kg-1灌服地塞米松。共計6 d。

1.3 實驗樣本獲取與處理末次激發(fā) 24 h 后處死小鼠，以磷酸鹽緩沖液1 mL行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞總數(shù)。然后4℃、3 000 r·min-1離心 10 min，取上清液， -80℃ 低溫保存，待測細胞因子。沉淀涂片，Diff-Quik染色，高倍鏡下進行細胞分類計數(shù)。取右肺下葉，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，進行HE染色。其余各肺葉放入液氮中速凍，-80℃保存。

1.4 BALF中細胞因子IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ含量的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，具體操作按試劑盒說明書進行，結(jié)果單位以pg·L-1表示。

1.5 免疫印跡參照延光海等[6]方法，取 200 mg 肺組織置入裂解液 0.5 mL勻漿，4℃ 12 000×g離心 2 min，取上清液,BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳，120 V，90 min，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液(25 mmol·L-1Tris, 150 mmol·L-1NaCl, 1% Tween 20, pH 7.5)室溫下封閉2 h，分別加入一抗4℃過夜，洗膜后再用 HRP標(biāo)記的二抗雜交，37℃ 1 h。洗膜后，在暗室中加ECL發(fā)光試劑，顯影及定影。雜交信號在圖像分析系統(tǒng)中進行光密度掃描。以β-actin 作為內(nèi)參對照。

2 結(jié)果

2.1 BALF中炎癥細胞的變化與正常組比較，哮喘組BALF中炎癥細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞計數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；芝麻素高劑量組和地塞米松組明顯降低哮喘小鼠BALF中上述細胞數(shù)量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，單核細胞在各組無明顯變化(Tab 1、Fig 1)。

Fig 1 Effect of sesamin on total and differential cellular components count in BALF of asthma model ±s，n=8)

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsOVA

2.2 芝麻素對BALF中細胞因子IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ濃度的影響哮喘組BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平升高，而IFN-γ水平降低，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；芝麻素高劑量組和地塞米松組能明顯降低哮喘小鼠BALF中細胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平，并提高IFN-γ水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(Tab 2、Fig 2)。

2.3 芝麻素對肺組織的病理學(xué)改變的影響HE染色結(jié)果顯示，正常組氣道無明顯改變; 模型組氣道壁變粗，氣道平滑肌增厚，炎癥細胞浸潤比較明顯，多層的炎癥細胞圍繞在氣管和血管周圍，黏膜下層增生；芝麻素高劑量組和地塞米松組能明顯減輕哮喘病理改變(Fig 3)。

Tab 1 Effect of sesamin on total and differential cellular components count in BALF of asthma model mice ±s, n=8，×105 ·ml-1)

#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA

GroupDose/mg·kg-1IL-4IL-5IL-13IFN-γNormal-80.23±8.5872.56±9.5738.98±7.5675.23±4.56OVA-298.23±12.56#458.60±18.35#85.69±6.35#25.36±2.34#Sesamin50254.35±10.58426.28±16.2489.34±7.8323.21±3.24Sesamin100178.69±10.56*278.69±15.67*65.78±7.25*42.38±4.69*DXM0.5123.89±9.85*152.78±10.89*45.67±8.13*68.54±5.23*

#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA

Fig 2 Effect of sesamin on levels of IL-4,IL-5,IL-13 and

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsOVA

2.4 芝麻素對肺組織IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ蛋白表達水平的影響哮喘組肺組織IL-4、IL-5和IL-13蛋白表達明顯增高，但IFN-γ蛋白表達明顯降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；芝麻素高劑量組和地塞米松組IL-4、IL-5和IL-13蛋白表達明顯降低，但IFN-γ蛋白表達明顯升高，與哮喘組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 4。

2.5 芝麻素對肺組織IκBα蛋白磷酸化的影響哮喘組肺組織的磷酸化IκBα蛋白表達高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與哮喘組比較，芝麻素高劑量組和地塞米松組磷酸化IκBα蛋白明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，總IκBα蛋白變化與磷酸化剛好相反(Fig 5)。表明芝麻素能明顯抑制哮喘小鼠IκBα磷酸化和IκBα的降解。

Fig 3 Effect of sesamin on pathologic changes in lung tissues of asthma model mice(HE staining, bar=50 μm)

Fig 4 Effect of sesamin on protein production of cytokines (IL-4,IL-5,IL-13 and IFN-γ) in lung tissue of

A:Western blot;B：Relative density.#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA.

Fig 5 Effect of sesamin on IκBα phosphorylation in

A:Western blot，B：Relative density.#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA.

2.6 芝麻素對NF-κB活化的影響哮喘組細胞核內(nèi)NF-κB p65明顯增加，但胞質(zhì)中NF-κB p65明顯減少，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。芝麻素高劑量組和地塞米松組細胞核內(nèi)NF-κB p65減少，而胞質(zhì)中NF-κB p65明顯增加，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明芝麻素有效減少NF-κB核轉(zhuǎn)位，抑制NF-κB活化(Fig 6)。

3 討論

支氣管哮喘是一種氣道和肺部慢性炎癥性疾病，浸潤的炎癥細胞主要以嗜酸性粒細胞為主，也包括肥大細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等。這些細胞釋放多種細胞因子，如Th1細胞因子IFN-γ和Th2細胞因子IL-4、IL-5 和IL-13等，Th1和Th2細胞因子表達的變化直接影響哮喘的發(fā)病。研究表明，芝麻素有明顯的抗炎作用。芝麻素通過抑制Δ5脂肪酸去飽和酶活性，降低炎癥介質(zhì)前列腺素E2和TNF-α。在LPS誘導(dǎo)的炎癥休克小鼠中，芝麻素能明顯降低IL-1β、前列腺素E2和血栓素B2水平，提高IL-6和IL-10的表達，從而提高小鼠的存活率[8]。本實驗研究顯示，芝麻素能明顯降低哮喘小鼠BALF中細胞總數(shù)和包括嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數(shù)量；減少哮喘小鼠BALF和肺組織中 IL-4 、IL-5 和IL-13水平，提高IFN-γ的表達；HE染色也顯示芝麻素減輕哮喘小鼠肺部炎癥細胞浸潤。芝麻素能明顯降低Th2代表細胞因子水平，提高Th1代表細胞因子的水平，并能明顯抑制哮喘小鼠肺部炎癥，提示芝麻素有明顯的抗哮喘炎癥作用。

Fig 6 Effect of sesamin on NF-κB activation in lung tissue of asthma model ±s,n=8)

A:Western blot;B：Relative density.#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsOVA.

哮喘炎癥與復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，有關(guān)哮喘的發(fā)病機制仍然不清楚。NF-κB是一個核轉(zhuǎn)錄因子，與包括哮喘等免疫和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[9-10]。正常NF-κB與NF-κB抑制蛋白IκBα結(jié)合并穩(wěn)定的存在于細胞質(zhì)中，當(dāng)細胞激活后，IκBα發(fā)生磷酸化并降解， NF-κB和IκBα復(fù)合體解離，暴露NF-κB核定位序列，NF-κB進入細胞核內(nèi)與目的基因特異性結(jié)合位點結(jié)合，促進包括IL-4、IL-5 和IL-13等目的基因的轉(zhuǎn)錄。Jeng等[2]研究發(fā)現(xiàn)，芝麻素通過抑制p38和NF-κB活化減低BV-2細胞IL-6 mRNA和蛋白的表達。Harikumar等[11]也發(fā)現(xiàn)芝麻素通過NF-κB調(diào)節(jié)KBM-5等多種腫瘤細胞存活、增殖和侵襲。Cui等[12]通過體內(nèi)和體外實驗證明了芝麻素通過ERK1/2和NF-κB信號途徑抑制細菌趨化肽誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，提示NF-κB可能是芝麻素潛在的作用靶點。本實驗顯示，哮喘小鼠IκBα磷酸化明顯增加，總IκBα明顯減少，同時細胞質(zhì)NF-κB p65減少，細胞核內(nèi)NF-κB p65增多，引起NF-κB核轉(zhuǎn)位。芝麻素能明顯抑制IκBα磷酸化，增加總IκBα的表達，同時增加細胞質(zhì)NF-κB p65，減少細胞核內(nèi)NF-κB p65，表明芝麻素能夠抑制IκBα磷酸化并減少其降解，阻止NF-κB p65與IκBα解離，抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位。綜上所述，芝麻素有明顯的抗哮喘作用，其作用機制部分是通過調(diào)節(jié)NF-κB激活。

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Sesamin attenuates inflammation response in a murine model of asthma

LI Liang-chang1, PIAO Hong-mei2, YAN Guang-hai1, QIN Xiang-zheng1, LI Guang-zhao1

(1.DeptofAnatomyandHistologyandEmbryology,YanbianUniversityMedicalCollege,YanjiJilin133002,China; 2.DeptofRespiratoryMedicine,YanbianUniversity,YanjiJilin133000,China)

Aim To investigate the effects of sesamin on inflammation response of asthma and to explore its possible mechanism of action. Methods Forty male BALB/c mice were randomly divided into five groups with 8 mice in each group: normal group, ovalbumin (OVA) group, sesamin low dose group, sesamin high dose group and dexamethasone(DXM) group. Asthma model mice were induced by OVAinvivo. The left lung was isolated for pathological examination. Experiment of ELISA and Western blot were used to determine the effect of sesamin on IL-4,IL-5,IL-13 and IFN-γ expression. Hematoxylin and eosin stain was used to investigate pathological examination in lung tissue. Western blot was performed to detect the IκBα phosphorylation and NF-κB nuclear translocation. Results The mice developed the following pathophysiological features of asthma: increased numbers of inflammatory cells, increased levels of IL-4, IL-5 and IL-13, decreased level of IFN-γ in bronchoalveolar lavage fluids(BALF) and lung tissues(P<0.05), and increased IκBα phosphorylation and NF-κB nuclear translocation in lung tissues(P<0.05). Administration of sesamin markedly reduced airway inflammatory cell recruitment, reduced the production of IL-4, IL-5, IL-13 and increased IFN-γ in BALF and lung tissues(P<0.05). The increased IκBα phosphorylation and NF-κB nuclear translocation after OVA inhalation were inhibited by the administration of sesamin. Conclusion Sesamin attenuates inflammation response of asthma through suppression of NF-κB activation

asthma；sesamin；airway inflammation；nuclear factor-kappa B；interleukin-4；interleukin-5；interferon-γ

時間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.023.html

2014-11-29,

2014-12-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81260665)；吉林省科技廳項目(No 20130101121JC)；吉林省教育廳項目(No吉教科合字2014第21號)

李良昌(1978-)，男，博士，講師，研究方向：過敏性疾病,Tel: 0433-2436152，E-mail:lclee@ybu.edu.cn; 李光昭(1962-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：過敏性疾病，通訊作者,E-mail: gzhli@ybu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.023

A

1001-1978(2015)03-0411-05

R-332；R284.1；R322.35；R364.5；R392.12；R562.25