王 珊，高奕紅

(咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000)

血清白蛋白是血漿中豐富的載體蛋白，可與許多內(nèi)源、外源性化合物相結(jié)合[1]，而結(jié)構(gòu)剖析比較成熟的蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白(bovine serum alhumin，BSA)，是研究蛋白質(zhì)與小分子的相互作用的對象；研究農(nóng)藥與牛血清白蛋白之間的結(jié)合作用，有利于深入了解農(nóng)藥對人、畜的中毒機制，對科學(xué)使用農(nóng)藥具有重要意義，也為藥物殘留檢測過程中提取液的選擇提供理論依據(jù)。

有機磷農(nóng)藥是一類施用的非常廣泛的農(nóng)藥，使用后會嚴(yán)重影響植物和水生生物的生長，從而對人類的健康構(gòu)成威脅[2]。但是關(guān)于有機磷-蛋白質(zhì)相互作用的報道還非常少[3-6]。作者以有機磷藥物草甘膦，馬拉·毒死蜱為例，研究有機磷與BSA相互作用。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白：分析純，百靈威試劑公司；草甘膦銨鹽(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)：分析純，鎮(zhèn)江江南化工有限公司；馬拉·毒死蜱(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)：分析純，浙江新安化工集團股份有限公司。

SPECORD 50型紫外可見吸收光譜：德國耶拿公司；RF-5301型熒光分光光度計：日本島津公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 所需溶液的配制

用濃鹽酸稀釋配置pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液；計算稱取牛血清白蛋白固體，配置濃度為2×10-6mol/L的溶液；分別用分析天平稱取0.281 7 g草甘膦銨鹽藥品、0.264 0 g馬拉·毒死蜱于小燒杯中，加水溶解，用玻璃棒引流，加入于容量瓶中，并洗滌燒杯和玻璃棒3次都加入容量瓶內(nèi)，然后加入蒸餾水進行定容，待快到刻度時用滴管逐滴加入直到液面與刻度線相切，并搖勻溶液。

1.2.2 比色管待測溶液的配制

取7支10.0 mL比色管，洗滌干凈，進行排號，依次用移液管加入2.0 mL pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液，2.0 mL 0.15 mol/L的氯化鈉溶液，2.0 mL的2×10-6mol/L的BSA溶液，用1 mL移液管依次向2～7號加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，然后以蒸餾水定容至10 mL，并搖勻。

1.2.3 測發(fā)射熒光

用RF-5301PC熒光分光光度計測發(fā)射熒光，固定λ=280 nm，掃描300～540 nm，分別用比色皿測1～7號比色管中溶液，并將所測的結(jié)果保存在同一圖中，保存數(shù)據(jù)。

1.2.4 測同步熒光

用RF-5301PC熒光分光光度計測同步熒光，固定λ=280 nm，掃描300～450 nm，分別用比色皿測1～7號比色管中溶液，并將所測的結(jié)果保存在同一圖中，保存數(shù)據(jù)。

1.2.5 測紫外吸收

用SPECORD 50型紫外可見分光光度計測紫外吸收，將其波長調(diào)整到190～600 nm，進行掃描空氣，掃描完空氣再依次將1～7號溶液分別倒入比色皿中，并放入紫外可見分光光度計進行檢測，并分別保存圖及其數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度的草甘膦銨鹽溶液、馬拉·毒死蜱溶液與牛血清白蛋白的熒光猝滅作用光譜圖

在實驗中各個濃度下草甘膦溶液馬拉·毒死蜱的加入,都能使BSA熒光強度發(fā)生不同程度的猝滅，見圖1、圖2。

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(草甘膦銨鹽)從1～7分別為0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L圖1 不同濃度草甘膦銨鹽溶液與牛血清白蛋白的熒光猝滅作用光譜圖

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(馬拉·毒死蜱)從1～7分別為0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L圖2 不同濃度馬拉·毒死蜱溶液與牛血清白蛋白的熒光猝滅作用光譜圖

熒光強度的下降說明這些大分子與BSA之間存在著相互作用,并且通過相關(guān)穩(wěn)定性的考察發(fā)現(xiàn)這種猝滅作用瞬間就能達到穩(wěn)定狀態(tài),12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。運用Stern-Volmer(斯特恩一沃爾默)方程：

F0/F=1+kqτ0c=1+KSVc

(1)

其中:F0為猝滅劑不存在時的熒光強度；F為加入猝滅劑后的熒光強度；kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)；τ0為沒有猝滅劑存在下測得的熒光壽命(τ0≈10-8s)；KSV為猝滅常數(shù)(Stern-Volmer 猝滅常數(shù))；c代表大分子的濃度。KSV值越大,則說明大分子與BSA間的相互作用越強，見圖3、圖4。

c(草甘膦銨鹽)/10-4c(草甘膦銨鹽)從1～7分別為0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L圖3 草甘膦銨鹽與BSA的Stern-Volmer曲線

c(馬拉·毒死蜱)/10-5c(馬拉·毒死蜱)從1～7分別為0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L圖4 馬拉·毒死蜱與BSA的Stern-Volmer曲線

由Stern-Vlomer 曲線擬合得到的方程、KSV和kq見表1。

表1 有機磷與BSA的Stern-Volmer 回歸方程及猝滅常數(shù)

由表1可知:kq值大于2×1010，猝滅常數(shù)KSV得出它們的猝滅常數(shù)都大于最大動態(tài)猝滅常數(shù)2.0×102mol/L，初步推斷2種有機磷對BSA的猝滅都為靜態(tài)猝滅。

對于靜態(tài)猝滅，熒光強度與猝滅劑的關(guān)系表達式推導(dǎo)求出:

(2)

通過雙倒數(shù)曲線(見圖5、圖6)和數(shù)據(jù)計算出草甘膦銨鹽的KLB=2.38×102L/mol，馬拉·毒死蜱的KLB=1.72×103L/mol。

c(草甘膦銨鹽)-1/104c(草甘膦銨鹽)從1～7分別為0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L圖5 草甘膦銨鹽與BSA的雙倒數(shù)曲線

c(馬拉·毒死蜱)-1/105c(草甘膦銨鹽)從1～7分別為0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L圖6 馬拉·毒死蜱與BSA的雙倒數(shù)曲線

對于靜態(tài)猝滅，熒光強度與猝滅劑的關(guān)系可由熒光分子猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)表達式推導(dǎo)求出:

lg[(F0-F)/F]=lgK0+nlgc

(3)

其中：K0為熒光猝滅反應(yīng)的平衡常數(shù)，n為結(jié)合點位數(shù)。以lg[(F0-F)/F]對lgc作雙對數(shù)圖，見圖7、圖8。

lgcc(草甘膦銨鹽)從1～7分別為0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L圖7 草甘膦銨鹽與BSA的雙對數(shù)曲線

lgcc(馬拉·毒死蜱)從1～7分別為0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L圖8 馬拉·毒死蜱與BSA的雙對數(shù)曲線

其線性方程的斜率和截距分別為為結(jié)合點位數(shù)n和lgK0，見表2。

表2 有機磷與 BSA 結(jié)合常數(shù)K0、結(jié)合點位數(shù)n

2.2 不同濃度的草甘膦銨鹽溶液、馬拉·毒死蜱溶液與牛血清白蛋白的同步熒光光譜圖

加入有機磷農(nóng)藥使BSA的內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅,同步熒光光譜具有簡化光譜、窄化譜帶和減少光譜重疊等優(yōu)點而常被用于探討蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化,氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基均有熒光產(chǎn)生，而色氨酸殘基是BSA中的主要熒光源.隨著有機磷農(nóng)藥濃度的增加，同步熒光光譜不斷猝滅，說明它們對BSA的構(gòu)象有影響，見圖9、圖10。

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(馬拉·毒死蜱)從1～7分別為0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L圖10 不同濃度馬拉·毒死蜱溶液與牛血清白蛋白的同步熒光光譜圖

由圖9、圖10可知：有機磷的加入可使BSA分子中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光發(fā)射光譜產(chǎn)生了一定的位移，說明有機磷對BSA的酪氨酸微區(qū)和色氨酸微區(qū)都有影響，結(jié)合位點更接近于色氨酸殘基，但同時使色氨酸微區(qū)的疏水作用增大，從而疏水性也增大。

2.3 不同濃度的草甘膦銨鹽溶液、馬拉·毒死蜱溶液與牛血清白蛋白的紫外吸收光譜作用

草甘膦銨鹽與馬拉·毒死蜱和BSA相互作用的紫外吸收光譜圖、純草甘膦銨鹽與純BSA紫外圖、馬拉·毒死蜱與純BSA紫外圖見圖11～圖14。

λ/nmc(草甘膦銨鹽)從1～7分別為0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L圖11 不同濃度草甘膦銨鹽溶液與牛血清白蛋白的紫外吸收光譜圖

λ/nmc(馬拉·毒死蜱)從1～7分別為0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L圖12 不同濃度馬拉·毒死蜱溶液與牛血清白蛋白的紫外吸收光譜圖

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(草甘膦銨鹽)=2×10-3 mol/L圖13 純草甘膦銨鹽與純BSA紫外圖

由圖11～圖14可知隨著有機磷農(nóng)藥用量增加，體系的吸光度呈規(guī)律性降低，說明基態(tài)的BSA與有機磷農(nóng)藥存在相互作用，形成復(fù)合物BSA吸收光譜的變化進一步驗證了有機磷農(nóng)藥對BSA的猝滅作用為靜態(tài)猝滅。

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(馬拉·毒死蜱)=2×10-3 mol/L圖14 馬拉·毒死蜱與純BSA紫外圖

3 結(jié) 論

作者利用了發(fā)射熒光，同步熒光光譜，紫外吸收光譜研究了不同濃度下的有機磷溶液與BSA的相互作用。通過計算其kq>2×1010L/mol·s，猝滅常數(shù)KSV得出它們的猝滅常數(shù)都大于最大動態(tài)猝滅常數(shù)2.0×102mol/L，所以有機磷草甘膦銨鹽和馬拉·毒死蜱與BSA的相互作用都屬于靜態(tài)猝滅過程，并求得了二者的結(jié)合位點數(shù)(n)和結(jié)合常數(shù)(K0)。實驗結(jié)果表明，隨著有機磷農(nóng)藥濃度的增加，同步熒光光譜不斷猝滅，它們對BSA的構(gòu)象有影響。因有機磷與蛋白質(zhì)具有較強結(jié)合作用。

[ 參 考 文 獻 ]

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