吳惠英， 周 燕， 左保齊

(1. 蘇州經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 蘇州 215009； 2. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院， 江蘇 蘇州 215123；3. 現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室(蘇州)， 江蘇 蘇州 215123)

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氯化鈣/甲酸溶解體系下絲素納米纖維的制備及其性能

吳惠英1，2， 周 燕1， 左保齊2，3

(1. 蘇州經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 蘇州 215009； 2. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院， 江蘇 蘇州 215123；3. 現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室(蘇州)， 江蘇 蘇州 215123)

采用氯化鈣/甲酸(FA)溶解體系溶解脫膠蠶絲形成絲素溶液，再將溶液干燥、去鹽，將絲素膜在甲酸溶液中二次溶解獲得絲素質(zhì)量分數(shù)分別為4%、6%、8%的紡絲液。采用滾筒收集裝置進行靜電紡絲，討論不同質(zhì)量濃度絲素溶液的紡絲性能，通過SEM、紅外以及體外降解等測試手段表征絲素納米纖維的性能。結(jié)果表明：低質(zhì)量分數(shù)(4%)紡絲液的黏度較低，會出現(xiàn)不連續(xù)液滴，高質(zhì)量分數(shù)(8%)紡絲液所紡纖維直徑較粗；實驗所用絲素質(zhì)量分數(shù)為6%的紡絲液紡成的纖維成形效果良好，直徑主要集中在150～250 nm區(qū)域內(nèi)。紅外分析表明：經(jīng)75%乙醇處理會促進絲素分子構(gòu)象由α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變。降解實驗表明，纖維在PBS溶液中降解60 d后質(zhì)量損失15%，纖維粗細不均勻且發(fā)生黏連；在放線菌蛋白酶溶液中降解48 h后質(zhì)量損失96.9%，纖維幾乎完全降解，降解程度較PBS溶液中更明顯。

氯化鈣/甲酸； 絲素納米纖維； 靜電紡絲； 流變行為； 表面形貌； 紅外光譜； 降解

隨著國內(nèi)外學(xué)者對蠶絲結(jié)構(gòu)及性能的研究不斷深入，蠶絲的應(yīng)用逐漸從傳統(tǒng)紡織領(lǐng)域向生物醫(yī)用材料轉(zhuǎn)變。再生絲素(SF)材料體現(xiàn)出良好的生物相容性、無污染、無刺激性及可降解性[1-2]，目前常被用來構(gòu)建組織工程支架材料，如人工皮膚、人工肌腱、人工血管等[3]。靜電紡絲法可制備與細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的納米級纖維，紡絲裝置簡單，成本低，可操作性強，是目前制備納米纖維最有效的方法之一[4-5]，而且纖維的成纖性及直徑控制與溶液的濃度、黏度等因素有著密切關(guān)系。

本文采用氯化鈣/甲酸(CaCl2-FA)溶解體系溶解脫膠蠶絲形成絲素溶液，再將溶液干燥、去鹽，將干燥后的絲素膜二次溶解于甲酸溶液中獲得絲素質(zhì)量分數(shù)為4%、6%、8%的紡絲溶液。采用自制滾筒收集裝置進行靜電紡絲，討論不同質(zhì)量分數(shù)絲素溶液的紡絲性能。文中測試了紡絲液的流變性，通過SEM、紅外光譜以及體外降解等測試手段表征CaCl2-FA溶解體系下絲素納米纖維的表面形貌、二級結(jié)構(gòu)以及體外降解性能。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與測試儀器

蠶絲(浙江湖州)，碳酸鈉(Na2CO3，上海試劑總廠)，氯化鈣(CaCl2，上海試劑總廠)，甲酸(江蘇強盛化工有限公司)，磷酸緩沖溶液(PBS)，放線菌蛋白酶(Actinomycetes Protease，Sigma公司)。

AR2000流變儀(美國TA公司)，Hitachi S-570場發(fā)射掃描電鏡(日本，Hitachi Limited公司)，Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)；，DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)。

1.2 CaCl2-FA溶解體系絲素納米纖維制備

1.2.1 脫 膠

將天然桑蠶絲用質(zhì)量分數(shù)為0.05%的Na2CO3溶液煮沸30 min，浴比為1∶20，脫膠后用60 ℃的去離子水反復(fù)清洗3次，然后置于60 ℃烘箱中烘干，備用。

1.2.2 絲素的溶解及靜電紡絲

將脫膠桑蠶絲溶于質(zhì)量分數(shù)為5.0%的CaCl2-FA溶液獲得再生絲素溶液，將溶液干燥成膜后在去離子水中去鹽24 h，并室溫干燥得到再生絲素膜。將絲素膜二次溶解于甲酸溶液中獲得絲素質(zhì)量分數(shù)分別為4%、6%、8%的紡絲液進行靜電紡絲。選用自制靜電紡絲裝置，以高速旋轉(zhuǎn)的滾筒作為接收裝置，如圖1所示。裝置主要由高壓電源、計量泵、注射器、滾筒、電動機等組成。選用9號針頭，紡絲流量為2 mL/h，滾筒轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，調(diào)整電壓和距離，使場強達到1 kV/cm，制備微納米纖維材料。后處理使用75%乙醇處理30 min，自然晾干，用于測試。

圖1 自制靜電紡絲裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of self-made electrospinning device

1.3 測試分析

1.3.1 絲素溶液的流變性分析

選用AR2000型流變儀，剪切速率控制在0.1～1 000 s-1，溫度為(25±0.5)℃，測試再生絲素溶液的黏度。

1.3.2 形貌觀察

采用Hitachi S-570掃描電鏡觀察靜電紡絲素納米纖維的表面形貌，噴金厚度為20～30 nm。

1.3.3 紅外分析

采用美國NicoLet 5700型紅外光譜儀測定靜電紡絲素納米纖維的分子結(jié)構(gòu)，掃描次數(shù)為32次，波數(shù)范圍為 4 000～500 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1。

1.3.4 體外降解性研究

選用PBS溶液以及放線菌蛋白酶溶液對纖維進行體外降解實驗。樣品放入PBS溶液進行降解，每3 d取樣，同時更換其他待測樣品中的PBS溶液繼續(xù)降解，PBS降解實驗持續(xù)60 d。放線菌蛋白酶于37 ℃溶解于0.05 mol/L(pH=7.4)的PBS溶液中，得到5 unit/mL的放線菌蛋白酶溶液。降解過程中每隔2 h取出樣品，同時用新配制的酶溶液更換原來的酶溶液，使其他的樣品繼續(xù)降解，酶溶液的體外降解實驗持續(xù)48 h。取出的樣品加入50 mL蒸餾水浸泡1 d，反復(fù)清洗，除去無機鹽，室溫干燥。將2種溶液降解后的纖維干燥后進行表面形貌觀察。計算質(zhì)量殘留百分率D。

式中：D樣品質(zhì)量殘留百分率；W0為降解前樣品絕對干態(tài)質(zhì)量；W1為降解后樣品絕對干態(tài)質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流變性分析

流變性質(zhì)對絲素溶液的成形加工及材料性能十分重要[6]。3種不同質(zhì)量分數(shù)的絲素溶液的流變曲線如圖2所示，隨著絲素含量的不同，紡絲溶液的黏度有所差異，但基本表現(xiàn)為隨剪切速率的增加黏度先遞增后遞減的趨勢。剪切速度較低時，絲素溶液中的原纖結(jié)構(gòu)彼此纏結(jié)明顯，使溶液黏度增加；隨剪切速度的逐漸增加，溶液中原纖結(jié)構(gòu)的彼此纏結(jié)程度減弱，纏結(jié)點的更多拆除致使溶液的黏度值下降明顯[7-9]。

圖2 不同質(zhì)量分數(shù)絲素溶液的流變曲線Fig.2 Rheological curves of SF solutions with different concentrations

2.2 纖維表面形貌觀察

不同質(zhì)量分數(shù)絲素溶液制得的靜電紡絲素納米纖維形貌如圖3所示。由圖可見絲素的質(zhì)量分數(shù)為4%時，纖維直徑較細，但會出現(xiàn)珠狀物，纖維平均直徑為(118±16) nm。低質(zhì)量分數(shù)絲素溶液的黏度較低，在電場力作用下，有時會以不連續(xù)液滴形式進行噴射。同時溶劑揮發(fā)不完全，纖維網(wǎng)的雜亂程度明顯，與傳統(tǒng)接收屏收集的纖維排列情況相似。當(dāng)絲素質(zhì)量分數(shù)增至6%時，纖維直徑分布主要集中在150～250 nm，纖維平均直徑為(221±20) nm，離散程度小，同時纖維網(wǎng)的取向程度有了大幅度提高，這是因為纖維直徑增大時，纖維的質(zhì)量增大，在相同電場強度的作用下飛行速度較小，在這過程中牽伸作用處于主導(dǎo)地位。隨絲素質(zhì)量分數(shù)的繼續(xù)增大至8%時，溶液黏度增加，絲素大分子鏈更易發(fā)生纏繞，在電場力作用下，溶液的較大表面張力使射流離開噴嘴后的分裂能力很難克服表面張力從而導(dǎo)致纖維直徑增加[10-11]，纖維的平均直徑達到(368.7±45) nm，離散程度大，取向程度變差。

圖3 絲素納米纖維的表面形貌Fig.3 SEM micrograph of SF nanofibers

圖4 絲素納米纖維的直徑分布Fig.4 Distribution of SF nanofibers

絲素納米纖維的直徑分布如圖4和表1所示。當(dāng)絲素質(zhì)量分數(shù)為4%時，纖維主要分布在50～250 nm間，直徑主要集中在100～150 nm區(qū)域內(nèi)，所占百分率為53%，而在200～250 nm區(qū)域內(nèi)，所占百分率只有2%；當(dāng)絲素的質(zhì)量分數(shù)增至6%時，纖維直徑主要分布在150～400 nm間，集中在150～250 nm區(qū)域內(nèi)，所占百分率為74%，其中200～250 nm區(qū)域內(nèi)，所占百分率達到36%；當(dāng)絲素的質(zhì)量分數(shù)增至8%時，纖維直徑主要分布在250～550 nm間，集中在350～400 nm區(qū)域內(nèi)，所占百分率為40%，且200～250 nm區(qū)域內(nèi)直徑分布為0。隨絲素質(zhì)量分數(shù)的不斷增加，相應(yīng)的纖維直徑逐漸增大，向大直徑方向移動。Yang等[12]驗證了直徑在250 nm的纖維有利于細胞生長，因此絲素質(zhì)量分數(shù)為6%的纖維從直徑上會更有利于細胞生長，適用于生物材料。

2.3 紅外光譜分析

圖6 絲素納米纖維降解曲線Fig.6 Degradation curve of SF nanofibers. (a) PBS; (b) Actionmycetes protesa

未經(jīng)乙醇處理的再生絲素材料是水溶性的，乙醇處理會改變材料的結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)量分數(shù)紡絲液制備的絲素納米纖維乙醇處理前后的紅外光譜圖如圖5所示。由圖可見，未經(jīng)75%乙醇處理的纖維其主要吸收峰出現(xiàn)在1 651 cm-1(AmideⅠ)處，歸屬于α-螺旋[13]，在1 528 cm-1(AmideⅡ)處附近出現(xiàn)吸收峰，歸屬于β-折疊，但峰不尖銳。經(jīng)過乙醇處理后，纖維的特征吸收峰在Amide I區(qū)發(fā)生了位置遷移，出現(xiàn)在1 628 cm-1處，歸屬于β-折疊，在Amide II區(qū)的吸收峰由1 528 cm-1遷移至1 519 cm-1，歸屬于β-折疊。相對未處理的樣品來說，處理后的樣品在Amide III區(qū)的1 231 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，歸屬于β-折疊。特征峰的轉(zhuǎn)變說明了乙醇處理后絲素分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，即從α-螺旋構(gòu)象到β-折疊的轉(zhuǎn)變。

注：a、b、c曲線為處理前的；d、e、f曲線為處理后的。圖5 絲素納米纖維的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR curves of SF nanofibers

2.4 體外降解后纖維質(zhì)量變化

將乙醇處理后的纖維放入降解液中進行體外降解實驗。利用質(zhì)量殘留百分率的變化表征材料在不同溶液中的降解速度。質(zhì)量殘留百分率大，質(zhì)量損失就慢，降解速率慢。在PBS溶液中，纖維的性質(zhì)比較穩(wěn)定，降解曲線如圖6所示。

由圖可知，降解1天后，纖維的質(zhì)量損失了0.8%，降解第30天時，累計的質(zhì)量損失為10.8%，降解60天時，累計的質(zhì)量損失為15%。說明再生絲素材料中的絲素蛋白質(zhì)大分子在降解過程中有小部分絲素大分子可溶于PBS降解溶液。

在放線菌蛋白酶溶液中纖維的降解曲線如圖6(b)所示。浸漬1 h后，纖維質(zhì)量損失了4.5%，10 h后，累計的質(zhì)量損失為36.4%，降解24 h后，累計的質(zhì)量損失為74.4%。降解48 h時，累計的質(zhì)量損失為96.9%，材料幾乎完全降解?？扇艿慕z素中，大部分能在24 h內(nèi)從絲素膜中溶解出來，相對PBS溶液來說，放線菌蛋白酶對絲素蛋白的降解有明顯的促進作用。

2.5 體外降解后纖維形貌

利用掃描電鏡對纖維在不同降解液中降解后的形貌進行觀察。纖維在PBS溶液中的降解形態(tài)結(jié)構(gòu)變化如圖7所示。纖維在降解初期發(fā)生吸水溶脹，隨著降解時間持續(xù)到第15 d時，纖維溶脹明顯，且粗細不勻，纖維平均直徑由未降解前的(221±20) nm增加到(413±28) nm，并發(fā)生部分黏連現(xiàn)象。到降解第60 d時，纖維直徑明顯變細，平均直徑降低到(82±15) nm，同一根纖維粗細嚴(yán)重不均勻，并出現(xiàn)斷頭。隨降解時間的持續(xù)，纖維斷裂并出現(xiàn)大部分纖維嚴(yán)重黏連的現(xiàn)象。

纖維在放線菌蛋白酶溶液中的降解形態(tài)結(jié)構(gòu)變化如圖8所示。纖維在放線菌蛋白酶溶液中的降解隨降解時間的不同，纖維形態(tài)有明顯變化。纖維在降解初期發(fā)生吸水膨脹，纖維黏連，連續(xù)的納米纖維部分發(fā)生斷裂。在降解10 h后，纖維被酶攻擊打斷。降解20 h后，由于絲素降解為大量碎片，絲素降解速度加快[3]。降解30 h后，絲素在酶溶液中最終崩塌，直至完全溶解，說明放線菌蛋白酶對絲素的降解能力較強。體外降解實驗表明，所制備的絲素納米纖維在PBS溶液和放線菌蛋白酶溶液中表現(xiàn)出不同的降解特性，也說明纖維具備良好的生物降解性，為其作為生物材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖7 絲素納米纖維在PBS溶液中降解后的SEM照片(×10 000)Fig.7 SEM of SF nanofibers at different degradation times in PBS solution (×10 000)

圖8 絲素納米纖維在放線菌蛋白酶溶液中降解后的SEM照片 (×10 000)Fig.8 SEM of SF nanofibers at different degradation times in actinomycetes protease solution (×10 000)

3 結(jié) 論

本文采用CaCl2-FA溶解體系溶解脫膠蠶絲形成絲素溶液，再將溶液干燥成膜、去離子水浸泡去鹽、室溫干燥形成再生絲素膜。將絲素膜二次溶解于甲酸溶液獲得絲素質(zhì)量分數(shù)分別為4%、6%、8%的紡絲液。結(jié)果表明，低質(zhì)量分數(shù)紡絲液(4%)的黏度較低，會出現(xiàn)不連續(xù)液滴，高質(zhì)量分數(shù)(8%)紡絲液所紡纖維直徑較粗。當(dāng)絲素的質(zhì)量分數(shù)增至6%時，纖維直徑分布主要集中在150～250 nm，纖維平均直徑為(221±20) nm，離散程度小，從直徑上會更有利于細胞生長，適用于生物材料。紅外分析表明，乙醇處理后，會促進絲素分子構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，即從α-螺旋構(gòu)象向β-折疊的轉(zhuǎn)變。纖維在PBS溶液中降解60 d后質(zhì)量損失15%，而在放線菌蛋白酶溶液中降解48 h后質(zhì)量損失96.9%，纖維降解為大量碎片直至崩塌。降解實驗表明，本文制備得到的絲素納米纖維具有可生物降解性，在放線菌蛋白酶溶液中的降解程度更明顯。

FZXB

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Preparation and property research of silk fibroin nanofibers in CaCl2-formid acid system

WU Huiying1,2， ZHOU Yan1， ZUO Baoqi2,3

(1.SuzhouInstituteofTrade&Commerce，Suzhou,Jiangsu215009，China; 2.CollegeofTextile&ClothingEngineering,SoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215123，China; 3.NationalEngineeringLaboratoryforModernSilk(Suzhou),Suzhou,Jiangsu215123，China)

CaCl2-formic acid (FA) system was adopted to dissolve degummed silk, and the silk fibroin(SF) solution was dried and desalted to obtain SF films. Then the SF films were dissolved in FA to obtain SF solutions with concentrations of 4%, 6% and 8%, respectively. The SF nanofibers were made by electrospinning with a cylinder collector. SEM, FT-IR and in vitro degradation were applied to characterize the properties of nanofibers. The results indicated that the viscosity of solutions of low concentration (4%) was low, and discontinuous droplets will appear when electrospinning, and the diameter of fibers spun from solutions of high concentration (8%) was larger. In this paper, the fibers spun from solutions of the concentration of 6% had good forming effect and the diameter was mainly at 150-250 nm. After treatment with 75% ethanol, the conformation of SF nanofibers was transformed from α-helical to β-sheet. The degradation tests demonstrated that after degradation in PBS for 60 d, the weight loss was 15%, and the fibers have uneven diameters and adhere with one another. After degradation in actinomycetes protease solution for 48 h, the weight loss was 96.9%, and fibers were nearly degraded completely. The degree of degradation is more evident than that in PBS.

CaCl2-formic acid; silk fibroin nanofiber; electrospinning; rheological behavior; surface morphology; FT-IR; degradation

10.13475/j.fzxb.20140806606

2014-09-01

2015-01-12

江蘇省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(BK20141207)；蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(SYG201431)；2015中國紡織工業(yè)聯(lián)合會科技指導(dǎo)項目(2015009)；2015蘇州經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然基金項目(KY-ZR1401)

吳惠英(1980—)，女，講師，博士生。主要從事絲蛋白生物材料的應(yīng)用研究。左保齊，通信作者，E-mail：bqzuo@suda.edu.cn。

TS 141.8

A