彭 忠，梁 婉，2，劉文靜，徐卓菲，譚 臣，吳 斌＊，周 銳，陳煥春

（1.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院農業(yè)微生物學國家重點實驗室，生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430070；2.華中農業(yè)大學動物科學技術學院農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430070）

多殺性巴氏桿菌是一種嚴重危害畜牧業(yè)的重要的革蘭陰性病原菌，對多種畜禽及野生動物甚至人都能造成不同程度的感染和致?。?－2］。依據(jù)莢膜抗原的不同，多殺性巴氏桿菌常被分為A、B、D、E、F 5種血清型［3］。臨床調查發(fā)現(xiàn)，不同血清型的多殺性巴氏桿菌表現(xiàn)出一定的宿主及致病偏好性［2］。多殺性巴氏桿菌的毒力因子眾多，目前已知的毒力因子主要包括莢膜、脂多糖（LPS）、黏附因子、巴氏桿菌毒素（PMT）、鐵攝取相關蛋白、唾液酸代謝、透明質酸酶以及外膜蛋白（OMP）［4］。

有研究發(fā)現(xiàn)［5－6］，革蘭陰性菌中1／3的蛋白合成后需要被轉運或分泌到細胞外發(fā)揮作用，包括某些水解酶類、細胞毒素、膠質類、生長因子、激素類或抗體等，這類蛋白被稱為分泌蛋白。分泌蛋白一般占細菌基因組編碼蛋白總量的10%～20%，它們不僅參與細胞信號轉導，而且對于細胞增值、分化及凋亡都具有十分重要的調控作用。因此，研究細菌的分泌蛋白對于了解細菌的生命周期及其致病機理以及病原菌與宿主間的相互作用具有十分重要的意義。然而，由于分泌蛋白不易被高濃度提取，這對于開展分泌蛋白研究產生了較大的阻礙。

隨著全基因組測序技術及生物信息學的發(fā)展，特別是細菌全基因組序列的測定和公布及配套生物信息學工具的開發(fā)為細菌分泌蛋白的預測和功能研究提供了巨大的幫助。自2001年分離于美國的禽源多殺性巴氏桿菌Pm70株的全基因組測序被報道后［7］，最近幾年又有幾株完整的多殺性巴氏桿菌全基因組序列被公布，其中的多殺性巴氏桿菌HN06株是一株來源于中國海南地區(qū)的D 型產毒素巴氏桿菌，分離自一頭患有萎縮性鼻炎病豬的鼻腔，其全基因組序列的測序于2012年完成并公布［8］，是世界上第1株完成全基因組序列測定的產毒素多殺性巴氏桿菌。本研究將利用Signal P、Tmhmm、Phobius、Target P、Lipop、GPI－SOM、Tat P、SecretomeP 等生物信息學工具預測出其分泌蛋白［9］，并將這些蛋白與其他3株多殺性巴氏桿菌（Pm70、3480、36950）的分泌蛋白進行比較分析，篩選出4株菌株共有的經典途徑Sec分泌蛋白，并對其進行了初步的功能分析，為進一步篩選多殺性巴氏桿菌亞單位疫苗候選蛋白奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

多殺性巴氏桿菌Pm70、3480、36950 及HN06的全基因組信息均下載于GenBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genome／genomes／912）；分泌蛋白預測及分析工具包括Signal P4.1（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）；Tmhmm v 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Tmhmm／）；Phobius（http：／／phobius.sbc.su.se／）；Target P1.1（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）；Lipo P1.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／LipoP／）；GPI－SOM（http：／／gpi.unibe.ch／）以及SecretomeP 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SecretomeP／）。

1.2 方法

1.2.1 Sec途徑分泌蛋白的篩選 分泌蛋白的氨基酸序列的N 端通常有一段10個～50個氨基酸的疏水性片段即信號肽［6］，用以引導隨后的蛋白質多肽鏈穿過內質網膜到達腔內，完成后，一些信號肽序列被信號肽酶切除，釋放出成熟的分泌蛋白。因此蛋白質序列N 端是否具有信號肽可以作為一個重要的預測依據(jù)。對Pm70、3480、36950及HN06等4個基因組的蛋白序列用Signal P4.1［10］，進行信號肽的預測，保留具有信號肽的蛋白。使用Tmhmm v2.0［11］篩選出具有0或1個跨膜螺旋的蛋白，由于該軟件在判斷具有1個跨膜螺旋的蛋白時，不能準確區(qū)分信號肽和跨膜區(qū)，因此需要使用Phobius軟件重新預測具有1個跨膜螺旋的蛋白，剔除確實具有跨膜區(qū)的蛋白［12］。再利用GPI－SOM 判斷上述篩選的蛋白中是否具有錨定位點，剔除錨定蛋白。最后，采用Target P1.1軟件預測蛋白的亞細胞定位，進一步確定該蛋白的分布類型，保留分泌型蛋白。上述篩選的蛋白在LipoP 軟件的預測下被分為4類，即被Ⅰ型信號肽酶識別的蛋白、被Ⅱ型信號肽酶識別的蛋白、細胞質蛋白和跨膜蛋白。

綜上所述，具有信號肽、不含跨膜螺旋、無GPI錨定位點、通過分泌途徑分泌且能被Ⅰ型和Ⅱ型信號肽酶識別的蛋白可初步預測為Sec分泌蛋白［13］。

1.2.2 Tat途徑分泌蛋白的篩選 使用Tat P 軟件篩選出具有RR 信號肽且D 值大于默認閥值0.36的蛋白，然后使用Tmhmmv 2.0和Phobius篩選出其中無跨膜螺旋結構的蛋白。

1.2.3 無信號肽的非經典分泌蛋白的篩選 用Signal P4.1篩選出沒有信號肽的蛋白，并用SecretomeP 2.0 軟 件 選 取secp 值 大 于0.5 的 序 列。經Tmhmmv 2.0和Phobius篩選，保留無信號肽、secp值大于0.5的無跨膜螺旋蛋白［14］。

2 結果

2.1 基因組和蛋白組信息搜集

多殺性巴氏桿菌Pm70、3480、36950 及HN06這4株多殺性巴氏桿菌的全基因組序列及蛋白質序列均來自于美國國家生物技術信息中心（NCBI），GenBank登 錄 號 分 別 為：NC－002663、NC－017764、NC－016808、NC－017027；其中HN06株的全基因組序列和蛋白質序列由華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室（湖北，武漢）提交。

2.2 多殺性巴氏桿菌HN06株分泌蛋白預測

2.2.1 Sec途徑分泌蛋白預測結果 使用Signal P4.1預測到多殺性巴氏桿菌HN06株含有179個具有信號肽的蛋白，進一步利用Tmhmmv 2.0軟件預測到這179個蛋白包括150個無跨膜螺旋的蛋白和22個只有1個跨膜螺旋的蛋白；經Phobius軟件檢查發(fā)現(xiàn)，具有1個跨膜螺旋的22個蛋白中有2個蛋白具有跨膜區(qū)。此外，使用GPI－SOM 軟件預測出10個錨定蛋白，排除后采用Target P 軟件確定其亞細胞定位，篩選出分泌型蛋白157個。最后，用LipoP 軟件篩選出能被Ⅰ型信號肽酶識別的蛋白120個，能被Ⅱ型信號肽酶識別的蛋白37個。

2.2.2 Tat途徑分泌蛋白預測結果 經Tat P 分析，共預測到HN06株中Tat途徑分泌蛋白8個。

2.2.3 非經典途徑分泌蛋白預測結果 HN06 株非經典途徑分泌蛋白共預測到208個。

2.3 多殺性巴氏桿菌HN06株分泌蛋白組成分析

多殺性巴氏桿菌全基因組共編碼2 265個開放閱讀框（open reading frame，ORF），經預測其中含有373個分泌蛋白，所占比例為16.5%；這些分泌蛋白中spⅠ、spⅡ、Tat P、非經典途徑分泌蛋白比例見圖1；就氨基酸就成個數(shù)而言，373個分泌蛋白中氨基酸數(shù)量最小為36 個，最大為2 987個，絕大多數(shù)蛋白質的大小皆位于0～350 個氨基酸殘基之間，占分泌蛋白總數(shù)的71.1%（圖2）。

信號肽是Ⅰ型和Ⅱ型分泌蛋白轉運過程中必不可少的一個元件，我們對其長度進行分析發(fā)現(xiàn)Ⅰ型分泌蛋白的長度分布在18 個～33 個氨基酸之間，其中19個～26個氨基酸的信號肽最多，占91.7%，Ⅱ型分泌蛋白的長度分布在15個～25個氨基酸之間，其中18個～19 個氨基酸的信號肽最多，占59.5%（圖3）。

圖1 HN06株分泌蛋白組成分布圖Fig.1 Pie chart of the distribution of HN06Sec proteins

圖2 HN06株分泌蛋白的ORF長度分布Fig.2 Distribution of the Sec protein ORF length of HN06

圖3 Ⅰ型和Ⅱ型分泌蛋白的信號肽長度分布Fig.3 Distribution of signal peptide length of the Sec proteins recognized by signal peptidaseⅠandⅡ

Tat途徑分泌蛋白的信號肽N 端含有一段RRmotif保守結構區(qū)，因此這種信號肽又稱RR－motif型信號肽，通常組成為RR－X－（FGAVML）－（LITMVF）［15］，X 為任意氨基酸。本研究對Tat途徑分泌蛋白的RR－motif信號肽進行分析發(fā)現(xiàn)，HN06中預測到的8個RR－motif均符合一般組成規(guī)律（表1）。

2.4 HN06分泌蛋白功能分析

2.4.1 Sec途徑分泌蛋白功能分析 根據(jù)HN06株蛋白注釋信息及功能不明確蛋白的Blastp發(fā)現(xiàn)預測到的120 個spⅠ型分泌蛋白中假設蛋白26個，所占比例21.7%。其余蛋白的功能主要是細胞壁合成酶、代謝相關酶類、水解酶及代謝相關蛋白。代謝相關蛋白中除ABC 轉運蛋白、磷酸結合蛋白外，還發(fā)現(xiàn)有7個鐵代謝相關蛋白、4個血紅蛋白結合蛋白及4個TonB 依賴性蛋白，這些都是病原菌鐵攝取途徑必須的蛋白。

表1 HN06株具有RR－motif的8個信號肽Table 1 8RR－motif signal peptides in Pasteurella multocida HN06

spⅡ型分泌蛋白又稱脂蛋白，在對其功能分析發(fā)現(xiàn)，假設蛋白11 個，所占比例30%，其余蛋白主要是代謝酶類和代謝相關蛋白。

2.4.2 Tat途徑分泌蛋白功能分析 預測到的8個Tat途徑分泌蛋白中有5個還原酶，1個代謝相關的脫氫酶，1個磷酸二酯酶及1個細胞分裂蛋白。

2.4.3 非經典途徑分泌蛋白 HN06株中共預測到非經典途徑分泌蛋白208 個，其中假設蛋白84個，所占比例40.4%。其余蛋白中DNA 復制相關蛋白和酶占16.3%，代謝酶類占9.6%，氧化還原酶類占6.3%，另外還有7個噬菌體相關蛋白、2個血紅素結合受體及熱擊蛋白、冷擊蛋白及黏附素等。

2.5 四株多殺性巴氏桿菌共有sec途徑分泌蛋白功能分析

對其他3株巴氏桿菌使用同樣的方法預測出其sec途徑分泌蛋白，并對這些分泌蛋白序列使用Blastp進行比對，共得到203個sec途徑分泌蛋白。各株菌所包含的sec途徑分泌蛋白的分布情況見圖4，四株菌共有的sec途徑分泌蛋白共114個，占總數(shù)的56.2%，至少在兩株菌中存在的sec途徑分泌蛋白共69個，占總數(shù)的34.0%，剩余的9.80%為各個菌株所特有。

圖4 Pm70、3480、36950及HN06株Sec分泌蛋白分布韋恩示意圖Fig.4 Venn diagram of the distribution of Sec proteins of Pm70，3480，36950and HN06strains

對這4株巴氏桿菌預測到的共有Sec分泌蛋白的功能分析發(fā)現(xiàn)，有13個功能未知的假設蛋白，所占比例為11.4%，其余的蛋白中代謝相關蛋白占39.5%，代謝酶類占9.65%，其中代謝相關蛋白中有31.1%是鐵代謝、血紅蛋白結合蛋白和TonB 依賴性蛋白。

3 討論

生物信息學的發(fā)展使得人們能夠將其廣泛的應用于科學研究中，更快速有效的獲取信息。但是不同的軟件有著不同的計算方式，預測的結果也不盡相同，甚至會有預測錯誤的現(xiàn)象出現(xiàn)，進一步驗證實驗十分必要。

在本次研究中，預測到巴氏桿菌HN06株分泌蛋白共373個，其中Sec分泌蛋白157個，Tat途徑分泌蛋白8 個，無信號肽的非經典途徑分泌蛋白208個。Sec分泌蛋白被Ⅰ型信號肽酶識別的有120個，被Ⅱ型信號肽酶識別的有37個。在對其功能分析后發(fā)現(xiàn)，Sec分泌蛋白中代謝相關蛋白和酶類及細胞壁水解和合成相關酶類較多，Tat途徑分泌蛋白中還原酶較多，而非經典途徑分泌蛋白中DNA 復制相關蛋白和酶類較多。Pm70、3480、36950及HN06這4株巴氏桿菌共有的Sec分泌蛋白中代謝相關蛋白較多，并且鐵代謝、血紅蛋白結合蛋白和TonB依賴性蛋白占有較大比例。

研究發(fā)現(xiàn)，鐵是病原菌生長所必須的微量營養(yǎng)元素，多殺性巴氏桿菌中鐵代謝相關基因占全基因組的2.5%。細菌通過鐵載體、轉鐵蛋白和血紅蛋白等多種螯合系統(tǒng)調控鐵的代謝，每種螯合系統(tǒng)都包括1個外膜受體，1個胞周質結合蛋白及1個胞內ABC轉運蛋白［16］。通過預測得知，巴氏桿菌的分泌蛋白中有較大比例參與了鐵的代謝，而其他代謝相關酶類等對于細菌的增殖、分化及毒力都有十分重要的意義。分泌蛋白是在細胞內合成后運送到細胞外發(fā)生作用的蛋白，它是細胞與外界環(huán)境發(fā)生相互作用的物質基礎。但是分泌蛋白在細胞代謝中具有的重要意義，需要更進一步的試驗證實，以便于更清晰的了解其代謝機制和致病原理，篩選出免疫原性更好的蛋白。

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