徐宏軍，楊鵬程，任 麗，胡來(lái)根，何孔旺，劉文倩，代洪波

（1.成都天邦生物制品有限公司，四川成都610100；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇南京210014）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種豬的急性腸道傳染病。該病于1971年在英國(guó)首次被報(bào)道，不久相繼在歐洲各國(guó)開(kāi)始流行。其在亞洲流行情況較歐洲更為嚴(yán)重，并呈現(xiàn)出哺乳仔豬高發(fā)病率、高致死率的特點(diǎn)［1］。我國(guó)于1976年首次報(bào)道該病，到2000年，該病已經(jīng)在全國(guó)范圍內(nèi)流行。特別是從2010年起，該病在我國(guó)的免疫豬群中再度流行，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了極大的危害［2－3］。新毒株的出現(xiàn)導(dǎo)致對(duì)目前CV777株疫苗毒免疫效力的質(zhì)疑，然而目前沒(méi)有更為合適的新的疫苗毒株出現(xiàn)，如何提高現(xiàn)有滅活疫苗保護(hù)力就成為防控PED 的研究熱點(diǎn)。本試驗(yàn)旨在通過(guò)使用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝制備高效價(jià)PED 滅活疫苗（CV777株），與普通轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)的PED 滅活疫苗（CV777株）及組織滅活苗進(jìn)行動(dòng)物攻毒保護(hù)對(duì)比試驗(yàn)，探索提高疫苗中的抗原含量是否能夠有效提高PEDV 疫苗的保護(hù)力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 T4DNA ligase、10×buffer for T4DNA ligase、pMD19－T simple vecter為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、DNA Marker DL 2 000、瓊脂糖凝膠DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、病毒RNA提取試劑盒、一步法RT－PCR 試劑盒為天根生物有限公司產(chǎn)品；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、新生牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞與毒株 DH5α菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存。Vero E6細(xì)胞、豬流行性腹瀉疫苗毒（CV777株）由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；豬流行性腹瀉病毒流行株（JS12株）由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。豬流行性腹瀉組織滅活苗由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

1.1.3 試驗(yàn)用動(dòng)物 豬流行腹瀉抗原、抗體陰性妊娠母豬，為四川眉山散養(yǎng)農(nóng)戶飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 PEDV 疫苗毒（CV777株）生物信息學(xué)分析

根據(jù)GenBank中公布的PEDV S基因主要中和位點(diǎn)序列（S基因1 495位～1 914位核苷酸），設(shè)計(jì)合成PEDV S 基 因 擴(kuò) 增 引 物 如 下：P1：5′－TTCTGAGTCACGAACAGCCA－3′；P2：5′－CATATGCAGCCTGCTCTGAA－3′。目的片段為650bp 左右，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。以天根生物病毒RNA 提取試劑盒，分別提取PEDV 疫苗株CV777株與流行毒株JS12株病毒RNA，以天根生物一步法RT－PCR 試劑盒方法進(jìn)行CV777株與JS12株S基因擴(kuò)增。分別回收RT－PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，鏈接至pMD19－T simple vecter，轉(zhuǎn)化DH5α感

受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆送上海英俊公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank上所提交的PEDV S基因核酸及氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，以DNA Star進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析。

1.2.2 PEDV 轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗的制備 以傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝在Vero E6細(xì)胞上對(duì)PEDV CV777株進(jìn)行增殖，待80%以上細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收獲病毒液，進(jìn)行半成品檢驗(yàn)。檢驗(yàn)合格后，病毒液用甲醛滅活后與60%氫氧化鋁膠佐劑以2∶1 比例進(jìn)行乳化，制備PEDV 轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗。按《中國(guó)人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2001年版）對(duì)疫苗進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.2.3 PEDV 懸浮培養(yǎng)高價(jià)滅活疫苗的制備 使用懸浮培養(yǎng)工藝（專利號(hào)：ZL20101013700.5）培養(yǎng)Vero E6 細(xì)胞，待滿球率大于90%時(shí)接毒進(jìn)行PEDV CV777 株懸浮培養(yǎng)。接毒劑量為0.01 MOI，接毒后定期取樣觀察細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲病毒液，進(jìn)行半成品檢驗(yàn)。檢驗(yàn)合格后，病毒液用甲醛滅活后與60%氫氧化鋁凝膠佐劑以2∶1 比例進(jìn)行乳化，制備PEDV懸浮培養(yǎng)高價(jià)滅活疫苗，按《中國(guó)人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2001 年版）對(duì)疫苗進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

1.2.4.1 分組與免疫 在四川眉山某鄉(xiāng)鎮(zhèn)散養(yǎng)農(nóng)戶家中采集妊娠母豬血液送至成都天邦生物制品有限公司診斷中心，以PEDV 抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PEDV 抗 體 檢 測(cè)，以PEDV 抗 原RT－PCR 檢 測(cè) 方法［4］與韓國(guó)Anigen公司PEDV 抗原膠體金檢測(cè)試劑盒同時(shí)進(jìn)行PEDV 抗原檢測(cè)。共篩選8 頭PEDV 抗原、抗體陰性妊娠母豬，分4 組進(jìn)行不同PEDV 疫苗的免疫，每組2頭。產(chǎn)前30d，各試驗(yàn)組分別免疫對(duì)應(yīng)疫苗（表1），免疫劑量為4mL／頭；對(duì)照組每頭注射4mL PBS。

1.2.4.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 試驗(yàn)?zāi)肛i產(chǎn)子后14d左右，每頭母豬選取5頭仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，攻毒之前仔豬均采用母乳飼養(yǎng)3d～5d，然后分組獨(dú)立飼養(yǎng)。按表2，每頭仔豬口服、肌肉注射PEDV 流行毒株（JS12 株）病毒液（107.0TCID50／mL）各1 mL。攻毒后連續(xù)觀察6d，每3h觀察一次，記錄試驗(yàn)仔豬是否出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐等流行性腹瀉癥狀，采集腹瀉仔豬肛門拭子，送成都天邦生物制品有限公司診斷中心進(jìn)行PEDV 抗原RT－PCR 檢測(cè)［4］。

表1 試驗(yàn)?zāi)肛i分組與免疫信息Table 1 The grouping and immune information of experimental sows

表2 仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)分組Table 2 The grouping and challenge－protection experiment in piglets

2 結(jié)果

2.1 PEDV 疫苗毒（CV777）生物信息學(xué)分析

將成都天邦生物制品有限公司現(xiàn)用PEDV CV777疫苗毒株S 基因測(cè)序結(jié)果命名為GSCV777，PEDV JS12流行毒株S基因測(cè)序結(jié)果命名為GS－JS12。以DNA Star軟件將JS12流行毒株、CV777疫苗毒株的S基因與GenBank上所提交的PEDV CV777株S基因序列，以及部分PEDV 流行毒株S基因序列進(jìn)行核苷酸與氨基酸的序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。成都天邦生物制品有限公司現(xiàn)用PEDV CV777 疫苗株S 基因核酸序列與CV777參考核酸序列相似性為99.7%，氨基酸序列同源性為99.5%，成都天邦生物制品有限公司現(xiàn)用CV777毒株在傳代使用過(guò)程中S 基因未發(fā)生明顯突變。PEDV CV777株S 基因與流行毒株的相似性在96.4%～99.7%之間，氨基酸序列相似性在96.7%～99.5%之間。

2.2 PEDV 轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗的制備

轉(zhuǎn)瓶工藝培養(yǎng)PEDV 半成品效價(jià)為107.0TCID50／mL。與氫氧化鋁佐劑2∶1乳化后制備成品疫苗，轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗成品抗原滴度計(jì)算值為106.82TCID50／mL。轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)等各項(xiàng)質(zhì)量檢驗(yàn)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 PEDV 懸浮培養(yǎng)高價(jià)滅活疫苗的制備

懸浮工藝培養(yǎng)PEDV 半成品效價(jià)為108.5TCID50／mL。與氫氧化鋁佐劑2∶1乳化后制備成品疫苗，轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗成品抗原滴度計(jì)算值為108.32TCID50／mL。轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)等各項(xiàng)質(zhì)量檢驗(yàn)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 PEDV S基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 Homology analysis of PEDV S gene nucleotide sequence

圖2 PEDV S基因氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Homology analysis of PEDV S gene amino acid sequence

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 臨床觀察 母豬產(chǎn)前30d分別免疫不同工藝制備的PEDV 滅活疫苗，母豬產(chǎn)仔后14d左右進(jìn)行仔豬PEDV 攻毒保護(hù)試驗(yàn)。攻毒后連續(xù)觀察6d，A 組（懸浮工藝滅活疫苗）10頭仔豬共有2頭出現(xiàn)腹 瀉 癥 狀，發(fā) 病 率20%（2／10），保 護(hù) 率80%（8／10）；B組（轉(zhuǎn)瓶工藝滅活疫苗）10頭仔豬共有8頭出現(xiàn)腹瀉癥狀，發(fā)病率80%（8／10），保護(hù)率僅為20%（2／10）；C組（組織滅活苗）10頭仔豬有9頭出現(xiàn)腹瀉癥狀，發(fā)病率90%（9／10）；D 組（對(duì)照）10頭仔豬全部出現(xiàn)腹瀉癥狀，發(fā)病率100%（10／10）。試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The test results of animal challenge protection

2.4.2 剖檢大體病變觀察 將發(fā)病仔豬在觀察期結(jié)束后進(jìn)行處死，仔豬均出現(xiàn)小腸鼓氣，腸壁變薄，腸系淋巴結(jié)腫大出血等PED 剖檢病變（圖3）。

圖3 病豬剖檢病理變化Fig.3 The pathological lesions of sick piglets

2.4.3 RT－PCR 檢測(cè)所采集腹瀉豬肛拭子PEDV結(jié)果 采集試驗(yàn)仔豬的肛拭子，通過(guò)RT－PCR 進(jìn)行PEDV 抗原檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。懸浮工藝滅活疫苗組共檢出2頭PEDV 抗原陽(yáng)性，轉(zhuǎn)瓶工藝滅活疫苗組共檢出7頭陽(yáng)性，組織滅活苗組共檢出7頭陽(yáng)性，對(duì)照組共檢出8頭陽(yáng)性。結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行保護(hù)率判定，母豬產(chǎn)前30d左右免疫接種1次，懸浮高價(jià)滅活疫苗保護(hù)率為80%（8／10）；轉(zhuǎn)瓶工藝滅活疫苗組保護(hù)率為20%（2／10）；組織滅活苗組10%（1／10）保護(hù)；對(duì)照組全部發(fā)病，0／10保護(hù)。

3 討論

近年來(lái)，PED 已成為危害養(yǎng)豬業(yè)重要的傳染病之一，在秋冬春三季常呈現(xiàn)大面積暴發(fā)的態(tài)勢(shì)。PEDV 雖只有一個(gè)血清型但毒株變異較大，在亞洲流行形勢(shì)復(fù)雜。楊漢春［5］曾報(bào)道基于對(duì)北京、河北、山東、河南、浙江等地區(qū)12個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)的臨床癥狀和腸道組織樣本的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，引起仔豬腹瀉的主要病原是豬流行性腹瀉病毒（PEDV），對(duì)毒株的全基因組序列測(cè)定表明，是一種新的毒株，其主要抗原表位基因S基因與我國(guó)鄰國(guó)韓國(guó)的同源性最高，而與傳統(tǒng)疫苗毒株CV777基因差異較大。毒株基因變異應(yīng)該是造成免疫失敗和仔豬死亡率高的主要原因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)分離毒株的全長(zhǎng)基因序列和棘突蛋白（S）基因序列長(zhǎng)度有差異，其他基因長(zhǎng)度保守性強(qiáng)。S 基因的變異率高于其他基因，特別是短期內(nèi)基因突變主要發(fā)生于S 基因。綜合分析認(rèn)為國(guó)內(nèi)變異毒株雖與韓國(guó)毒株遺傳關(guān)系較近，但從境內(nèi)毒株衍生和進(jìn)化而來(lái)的可能性更大［6］。

PEDV 分離難度大，細(xì)胞適應(yīng)性差是目前疫苗毒株難以更換的主要原因。1988 年Hofmann M等［7］首次報(bào)道在細(xì)胞維持液中添加一定劑量的胰酶可以使PEDV 在Vero細(xì)胞上增殖，人們才開(kāi)始能夠在傳代細(xì)胞上對(duì)PEDV 進(jìn)行培養(yǎng)。雖然其后有很多人在進(jìn)行PEDV 在傳代細(xì)胞上培養(yǎng)的研究，相繼 有 在IBRS－2、PK－15 細(xì) 胞 系 上 培 養(yǎng) 成 功 的 報(bào)道［8－9］，但這仍是制約獲得新的合適的疫苗毒株的主要因素。組織滅活苗在防治PED 的歷史上發(fā)揮了重要的作用［10］，但制備成本高，效價(jià)難以穩(wěn)定，安全性差都是其不可避免的缺點(diǎn)。在本次試驗(yàn)中，我們可以觀察到組織滅活苗在3個(gè)試驗(yàn)組中雖然毒株針對(duì)性最強(qiáng)，但保護(hù)率卻最差（10%）。究其原因可能是使用小腸組織及內(nèi)容物反復(fù)凍融后的上清溶液作為抗原，因?yàn)榉磸?fù)凍融并不能保證病毒的完全釋放，因而很難保證疫苗中的抗原含量，從而導(dǎo)致最終的試驗(yàn)結(jié)果。所以，組織滅活疫苗已經(jīng)逐漸被淘汰。

面對(duì)以上問(wèn)題，如何能夠在使用傳統(tǒng)疫苗毒株CV777的條件下提高疫苗保護(hù)力成為目前PED 疫苗的主要研究重點(diǎn)。國(guó)內(nèi)學(xué)者的主要觀點(diǎn)是在疫苗中提高抗原含量能夠在一定程度上增強(qiáng)疫苗保護(hù)力。2011年福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜禽水產(chǎn)疾病診療中心［11］對(duì)福建省內(nèi)184份頑固性腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，豬流行性腹瀉感染96份，占52.2%。哺乳仔豬為主要感染對(duì)象，一旦感染發(fā)病率100%，病死率為80%～100%。同時(shí)研究人員還發(fā)現(xiàn)在只進(jìn)行過(guò)一次傳染性胃腸炎－流行性腹瀉二聯(lián)疫苗或三聯(lián)疫苗免疫的規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)較進(jìn)行過(guò)兩次免疫的養(yǎng)殖發(fā)病情況更為嚴(yán)重。上述調(diào)查報(bào)告從側(cè)面印證了學(xué)者的觀點(diǎn)。為證實(shí)此種觀點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了本次試驗(yàn)。在試驗(yàn)中，我們使用擁有專利技術(shù)的豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法（ZL 20101013700.5）進(jìn)行PEDV（CV777株）滅活苗的抗原制備，使其在滅活前效價(jià)達(dá)到108.5TCID50／mL，是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)工藝所制備的疫苗抗原配苗標(biāo)準(zhǔn) （國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)107.0TCID50／mL以上為合格）30倍。通過(guò)攻毒保護(hù)試驗(yàn)，可以明顯看出通過(guò)提高抗原含量的方法能夠有效提高疫苗保護(hù)力（懸浮培養(yǎng)苗保護(hù)率80%，普通轉(zhuǎn)瓶苗保護(hù)率20%）。近年來(lái)，我國(guó)不斷暴發(fā)豬流行性腹瀉疾病，目前國(guó)內(nèi)豬流行性腹瀉的預(yù)防疫苗以轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)為主 （質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為107.0TCID50／mL），對(duì)PEDV 流行毒株的保護(hù)效果欠佳，導(dǎo)致用戶對(duì)疫苗毒株免疫效果的質(zhì)疑［12］。試驗(yàn)通過(guò)懸浮培養(yǎng)技術(shù)提高豬流行性腹瀉病毒疫苗株抗原效價(jià)，能夠給流行毒株提供有效保護(hù)，消除對(duì)現(xiàn)用疫苗毒株有效性的質(zhì)疑，為今后PED 疫苗的研制與生產(chǎn)提供了新的方向。

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