黃 娟 劉 浩 鄧 沖

·短篇論著·

RRM1蛋白表達與體外藥敏實驗檢測對指導(dǎo)非小細胞肺癌化療的價值

黃 娟1劉 浩2鄧 沖3

肺癌，非小細胞； 核苷酸還原酶亞單位MI； 吉西他濱； 藥敏實驗； 個體化治療

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是目前威脅人類健康與生命最大的惡性腫瘤之一。即使可切除的NSCLC患者5年生存率仍令人失望，改善術(shù)后NSCLC患者局部控制率及遠期生存率一直是臨床關(guān)注的焦點，個體化化療是21世紀胸外科臨床發(fā)展的方向和理想治療模式[1]。本研究采用免疫組織化學(xué)檢測40例NSCLC患者手術(shù)切除的新鮮組織標本中核苷酸還原酶M1亞基(ribonucleotide reductase subunit M1, RRM1)蛋白表達水平，同時進行體外原代培養(yǎng)，MTT藥敏試驗，檢測臨床常用非小細胞肺癌一線化療藥物吉西他濱(Gemcitabine)的敏感性，比較分析RRM1表達與吉西他濱耐藥的相關(guān)性。旨在探討其在NSCLC個體化治療中療效的意義，為敏感藥物的選擇提供參考。

材料與方法

一、 實驗材料

1. 肺癌細胞: 收集2012年3月至2013年9月我科NSCLC患者手術(shù)切除的新鮮組織標本40例?；颊吣挲g38～68歲，平均年齡53歲，其中，男29例，女11例，均為Ⅰ-ⅢA期，肺腺癌23例、肺鱗癌15例，大細胞癌2例。

2. 化療藥物: 吉西他濱規(guī)格為200 mg/支，產(chǎn)地江蘇豪森藥業(yè)，試驗藥物濃度按文獻[1]配制，用無菌生理鹽水配成母液，按照實驗藥物濃度的0.5倍、1.0倍、2倍的劑量進行配制，保存于-20 ℃。

3. 主要試劑: RRM1多克隆抗體(美國PROTEINTECH公司)；免疫組化(SP)試劑盒(美國DACO公司)；DAB顯色試劑盒(美國DACO公司)；RPMI-1640(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Amresco公司)；淋巴細胞分離液：(天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；小牛血清:(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT(四甲基氮唑藍):(美國Amresco公司)；DMSO: 二甲基亞砜。

4. 實驗儀器: 分析純(美國Sigma公司)；離心機(Anke TGL-16B, 上海安亭科學(xué)儀器廠)；超低溫冰箱(Revco Value Series, thermo fisher scientific LLC)；電子天平(AUY220, SHMADZU)；CO2培養(yǎng)箱(HARRIS-301T, HARRIS)；倒置光學(xué)顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)；96孔細胞培養(yǎng)板(Costar公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀((Freedom Evolyzer-2，TeCan)；電子恒溫三用水箱(達佳，廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司)；蠕動泵(MILLPORE公司)；微量振蕩器(MH-1型，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)

二、研究方法

1. MTT法吉西他濱體外藥敏檢測: 單細胞懸液按文獻[1]制備，取手術(shù)切除的新鮮癌組織約1.0 cm3大小，選取無壞死部分，立即浸入無菌培養(yǎng)瓶中，10 min內(nèi)轉(zhuǎn)運至實驗室。在超凈臺上，用無菌PBS液沖洗2次，切除組織包膜，結(jié)締組織與壞死組織，剪成盡可能小的組織碎塊，大小約1 mm3。將組織小塊置于0.25%胰酶40 ml中，裝入培養(yǎng)瓶，置于37 ℃水浴箱中30 min，并不時搖動，使其充分消化，期間在鏡下觀察，當細胞變圓接近脫壁時，棄消化液，用10 ml完全-1640終止消化。用200目篩網(wǎng)將消化后的細胞懸液過濾收集，用無菌PBS液洗滌2次(離心半徑 8 cm，1500 r/min，離心 20 min)，懸于20 ml完全-1640中，鏡下觀察細胞。于無菌離心管中依次輕輕加入100%及60%的淋巴細胞分離液各10 ml，其上再沿管壁輕輕加入細胞懸液(離心半徑 8 cm，2000 r/min，離心20 min)，收集60%分離液界面上的細胞，加5倍無菌PBS液(離心半徑 8 cm，2000 r/min，離心20 min)，去上清，加15ml無菌PBS液，離心前進行細胞計數(shù)，再次離心，(離心半徑 8 cm 2000 r/min，離心20 min)去上清，調(diào)整細胞濃度為(1×105～2×105/ml)。種96孔板，分別設(shè)加藥孔，陰性對照孔，空白孔，并設(shè)3復(fù)孔。在7 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加藥孔加入吉西他濱，陰性對照孔與空白孔均加完全-1640，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，MTT法進行藥敏檢測，參照《細胞培養(yǎng)》[2]計算活性抑制率，當加藥組血漿高峰濃度水平時的抑制率大于50%時,即為高敏，小于30%為耐藥，介于2者之間為中敏。

2. SP法RRM1蛋白表達水平檢測: 手術(shù)切除的新鮮組織標本40例，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP 法)進行免疫組化檢測其RRM1蛋白，實驗步驟按SP試劑盒說明書進行。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，組間比較用四格表的確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

40例新鮮組織標本體外藥敏實驗對吉西他濱敏感者22例，耐藥18例。40例石蠟包埋標本RRM1高表達17例，低表達23例。17例RRM1高表達組，對吉西他濱敏感7例，敏感率41.2%，而23例RRM1低表達組，對吉西他濱敏感17例，敏感率73.9%，見表1。對同時滿足RRM1低表達組中MTT藥敏提示對吉西他濱敏感者選用GP(順鉑+吉西它濱)方案化療4個療程，其余選用可接受的二線方案(順鉑+多西他賽)化療4個療程。對照組40例以國際公認標準方案或經(jīng)驗用藥為主，包括順鉑+長春瑞濱，順鉑+紫杉醇，順鉑+長春花堿，順鉑+吉西它濱，順鉑+多西他賽等化療方案。隨訪6個月～2年，實驗組與對照組完全緩解(CR)+部分緩解(PR)即有效率分別為44.5%和42.4%、疾病穩(wěn)定(SD)分別為32.5%和28.1%、疾病進展(PD)分別為25.3%和28.5%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而中位生存時間(MST)分別為19.3個月和14.8個月(P<0.05),中位無進展生存(PFS)為6.7個月和6.5個月(P>0.05)，見表2。

表1 RRM1蛋白表達與吉西他濱體外藥敏實驗的相關(guān)性

表2 兩組化療效果比較

注：CR：完全緩解；PR：部分緩解；SD：疾病穩(wěn)定；PD：部分緩解；MST：中位生存時間；PFS：中位無進展生存

討 論

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度很高，其發(fā)病率及病死率均居首位[2]。其中80%的肺癌是NSCLC，手術(shù)已成為早期NSCLC的標準治療。但約1/3甚至近1/2的NSCLC就診時已屬晚期，可手術(shù)切除的患者5年生存率僅為30%～40%[3]，故化療在術(shù)后局部控制及提高遠期生存方面起著重要作用。但選擇對NSCLC有效的化療藥物，一直是臨床腫瘤化療關(guān)注的問題。

針對NSCLC術(shù)后化療藥物的選擇，國內(nèi)外多采用耐藥蛋白的測定，藥敏實驗或經(jīng)驗用藥等提高療效，但術(shù)后10%～15%的患者經(jīng)歷復(fù)發(fā)，15%～60%的患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[4]。究其原因，NSCLC不同患者對同一種化療藥物敏感性可能不同，并與肺癌細胞的生物學(xué)特性、患者個體差異、化療藥物的毒性反應(yīng)等多因素相關(guān)。目前，各級醫(yī)院采用同一個化療方案治療不同的NSCLC患者，帶有一定的盲目性?；颊咭虿±眍愋图皞€體差異的原因?qū)熕幬锏拿舾行杂休^大差異，因此越來越多的耐藥蛋白的檢測以及不同的體外藥敏試驗方法應(yīng)用于臨床，作為選擇敏感化療方案，實行個體化治療的手段。

吉西他濱作為NSCLC化療的一線藥物，具有一定優(yōu)勢得到普遍認可[5-6]。但耐藥的發(fā)生減弱了吉西他濱在NSCLC治療中的療效。RRM1是核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase, RR)的一個亞單位，RR使核糖核酸轉(zhuǎn)變成的脫氧核苷酸是DNA合成和修復(fù)所必需的物質(zhì)。RRMl定位于染色體11ql5.5區(qū)域，以上特性決定了 RRMl可能與NSCSL患者的化療耐藥與預(yù)后相關(guān)[7-8]。Rosell等[9]研究認為RRMl是吉西他濱的分子作用靶點，多項研究顯示吉西他濱耐藥與RRM1蛋白表達相關(guān)，但臨床治療NSCLC可選擇的藥物有很多種，進行單一生物學(xué)標志物RRM1的檢測其預(yù)測能力是不足的。故本實驗加入了更精細的細胞培養(yǎng)技術(shù)與體外藥敏試驗技術(shù)相結(jié)合的方法進行聯(lián)合檢測，期望達到更精確的個體化治療[10-16]。

我們將80例患者隨機分為2組，患者均在自愿接受不同治療方案前簽署知情同意書，我們用免疫組織化學(xué)方法檢測40例NSCLC手術(shù)切除的新鮮組織標本的核苷酸還原酶M1亞基(RRM1)蛋白表達水平，RRM1低表達23例，同時對新鮮腫瘤組織進行體外原代培養(yǎng)，并作了MTT藥敏試驗，其中17例對吉西他濱敏感，RRM1高表達17例，其中7例對吉西他濱敏感，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示RRM1低表達多數(shù)對吉西他濱敏感，RRM1高表達多數(shù)對吉西他濱耐藥，針對低表達組中對吉西他濱敏感的患者我們選用標準一線化療方案吉西他濱+順鉑，而其余患者選用二線方案多西他賽+順鉑。另外40例對照患者在經(jīng)驗用藥方案下接受治療，結(jié)果顯示實驗組有效率分為44.5%，對照組為42.4%、實驗組SD為32.5%，對照組為28.1%、實驗組PD為25.3%，對照組PD為28.5%，實驗組PFS為6.7個月，對照組為6.5個月，4組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而實驗組MST為19.3個月，對照組為14.8個月，P<0.05。表明將RRM1蛋白的表達與吉西他濱體外藥敏實驗相結(jié)合的治療方法可使患者獲得更長的生存期。

本研究結(jié)果顯示：將RRM1蛋白表達與吉西他濱體外藥敏實驗相結(jié)合，可作為NSCLC個體化治療的選擇之一。將該方法應(yīng)用于臨床，建立肺癌藥敏檢測系統(tǒng)，可使患者獲得更長的生存期，在肺癌的綜合治療中具有一定的臨床實用價值。本研究中涉及的免疫組化方法，肺癌細胞原代培養(yǎng)及MTT試驗均為常見試驗技術(shù)，該方法重復(fù)性好、操作簡便、利于推廣。

但本研究也有不足之處：試驗病例較少，前述結(jié)論需在以后的病例收集中進一步驗證。實驗組選用多西他賽+順鉑方案未做耐藥蛋白檢測及體外藥敏試驗，部分患者也可能耐藥。該方法中的難點在于肺癌細胞的原代培養(yǎng)，尤其是滿足藥敏試驗的肺癌細胞數(shù)是關(guān)鍵，若要推廣還需進一步簡化試驗流程，才能使該方法更加成熟。

1 劉 浩, 洪志鵬, 尹小川, 等. 人非小細胞肺癌細胞的原代培養(yǎng)及個體化藥敏實驗研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2011, 4(2): 94-97.

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4 Roth JA, Cox JD, Hong WK. 主編. 張?zhí)m軍, 張 力, 龍 浩, 等主譯. 肺癌[M]. 第3版. 北京：世界圖書出版公司, 2011: 222.

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16 Bepler G, Kusmartseva I, Sharma S, et al. RRM1 modulated in vitro and in vivo efficacy of Gemcitabine and Platinum in non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2006, 24(29): 4731-4737.

(本文編輯：黃紅稷)

黃 娟，劉 浩，鄧 沖. RRM1蛋白表達與體外藥敏實驗檢測對指導(dǎo)非小細胞肺癌化療的價值[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(1)： 76-78.

·醫(yī)學(xué)動態(tài)·

科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn)：注射細菌殺滅癌細胞

近日，在好萊塢舉辦的年度臨床介入腫瘤學(xué)研討會上，來自Anderson癌癥研究中心的研究人員通過研究揭示了，利用細菌或許可以幫助治療癌癥。研究人員將一種名為諾維氏芽孢桿菌-NT(Clostridium novyi-NT)的細菌的孢子注射入6位病人機體的腫瘤中，隨后細菌就可以在腫瘤中生長并且殺滅癌細胞。

在將諾維氏芽孢桿菌-NT注射入癌癥病人機體之前，研究人員首先通過移除該細菌的危險毒素來降低細菌的危險性；研究結(jié)果顯示6位病人均存活下來了，但其中有一位病人在細菌注射后因一些非相關(guān)的原因發(fā)生了死亡。研究者Ravi Murthy表示，當腫瘤生長達到一定尺寸后，其中一部分腫瘤組織就不再需要氧氣了，其就會對常規(guī)的癌癥療法產(chǎn)生耐受性，比如對放療和化療產(chǎn)生耐受等；而諾維氏芽孢桿菌-NT則可以在無氧狀態(tài)下生存從而在不影響正常組織的情況下破壞腫瘤細胞，同時該細菌也會誘發(fā)機體對癌癥產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

從本質(zhì)上來講，諾維氏芽孢桿菌-NT在腫瘤組織中可以引發(fā)潛在的殺滅癌細胞的感染過程，本文研究對于后期開發(fā)新型的抗癌療法提供了新的研究思路和依據(jù)。

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.01.020

四川省瀘州市科技局基金資助(2012-177)

646000 四川，瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科1646000 四川，瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院胸外科2、 中心實驗室3

劉 浩， Email: liuhaoer@sina.com

R563，R734.2

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2014-06-22)