翟曉虎+賀衛(wèi)華+沈曉鵬+陳世杰

摘要：探索優(yōu)化并構(gòu)建S100A16原核表達(dá)載體、制備S100A16蛋白多克隆抗體的條件。試驗(yàn)方法為，將RT-PCR擴(kuò)增得到的小鼠肝臟組織的S100A16基因克隆片段連接到帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET-28a多克隆位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），用不同溫度、不同濃度IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，通過親和層析柱純化獲得純化的蛋白質(zhì)。經(jīng)免疫動(dòng)物得到His-S100A16抗血清，通過免疫親和層析獲得了具有高度特異性抗體，通過Western Blot和Elisa檢測(cè)抗體的特異性和效價(jià)，結(jié)果表明，在溫度25 ℃、IPTG濃度為0.2 mmol/L的條件下，可溶性蛋白的表達(dá)效果較好。

關(guān)鍵詞：S100A16;Western Blot;融合蛋白表達(dá);ELISA;小鼠

中圖分類號(hào)： Q785 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0039-02

收稿日期：2014-04-01

基金項(xiàng)目：江蘇省泰州市農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（編號(hào)：TN2013012）。

作者簡(jiǎn)介：翟曉虎（1981—），男，山西渾源人，碩士，講師，主要從事小動(dòng)物疾病方面的研究。Tel：（0523）86651732;E-mail：zhaixiaohu010@163.com。

S100A16基因是在應(yīng)用全基因組微陣列芯片技術(shù)篩查代謝性疾病相關(guān)基因的研究中新獲得的差異表達(dá)基因，是鈣調(diào)蛋白S100家族的新成員，除了具有S100家族的基本結(jié)構(gòu)特征，還存在更復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。S100家族在細(xì)胞的增生、分化、遷移與凋亡，神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)與認(rèn)知形成及腫瘤發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用[1]。關(guān)于其新成員S100A16基因與疾病發(fā)展的研究尚淺，目前尚無明確結(jié)論，經(jīng)有關(guān)科研機(jī)構(gòu)研究，初步闡明S100A16基因在代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究擬探討并優(yōu)化S100A16多克隆抗體的制備條件與方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭白兔，購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，成年公兔體質(zhì)量4～5 kg，母兔體質(zhì)量4.5～55 kg。

1.2 試驗(yàn)儀器

主要試驗(yàn)儀器有：Eppendrof 5810冷凍離心機(jī)，凝膠成像儀，BioTek酶標(biāo)儀，BioTek洗板機(jī)，普通PCR儀，冷凍離心機(jī)，Thermo電動(dòng)移液器，Nuaire生物安全柜，三洋高壓滅菌鍋，Revco超低溫冰箱，Milipore純水儀，制冰機(jī)，振蕩器，分光光度計(jì)，電泳設(shè)備，國(guó)產(chǎn)大龍移液器。

1.3 試驗(yàn)試劑

PBS（磷酸鹽緩沖液，含蛋白酶抑制劑、1%TritionX-100、5%甘油）、PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液）、1 L TBS（Tris-HCl緩沖鹽溶液）、TBST 洗脫液（1 L TBS溶液中加0.5 mL Tween20）、LB培養(yǎng)基、SDS（十二烷基磺酸鈉）電泳液、轉(zhuǎn)膜液、封閉液、10% SDS、10% APS、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）、UREA（尿素）、PMSF（苯甲基磺酰氟）、IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、AMP（氨芐西林）、卡那霉素（Kana）、曝光顯色劑、025%考馬斯亮藍(lán)G250、脫色液等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 接種活化 接種活化方法按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.4.2 傳代培養(yǎng) 于滅菌三角搖瓶?jī)?nèi)加50 mL LB（含50 μg/mL Kana），接種1 mL已轉(zhuǎn)化His-S100A16的大腸桿菌BL21（DE3）過夜活化，于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)5～6 h。

1.4.3 擴(kuò)大培養(yǎng) 在1 L滅菌三角搖瓶?jī)?nèi)加450 mL LB（含50 μg/mL Kana），接種50 mL傳代His-S100A16轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21（DE3），于37 ℃、220 r/min條件培養(yǎng)1～2 h。

1.4.4 誘導(dǎo)培養(yǎng) 待擴(kuò)大培養(yǎng)的His-S100A16的D600 nm約為0.6時(shí)，取500 μL菌液留樣，再加誘導(dǎo)劑IPTG，150 r/min 下過夜誘導(dǎo)。為了使蛋白盡量以可溶性形式表達(dá)，試驗(yàn)設(shè)5個(gè)溫度條件，A、B、C、D、E組分別為16、20、25、30、37 ℃，每個(gè)組的IPTG濃度均設(shè)4個(gè)梯度：0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L。

1.4.5 菌體收集處理 （1）菌體收集：先取500 μL菌液，于12 000 r/min離心2 min，棄上清，加100 μL 1×loading buffer，用漩渦器將EP管底部菌體打散，在干式恒溫器中96 ℃變性10 min;然后于12 000 r/min離心2 min，轉(zhuǎn)移上清到新的EP管中，作標(biāo)記后-20 ℃保存;取出后于4 ℃、6 000 r/min離心15 min，棄上清。（2）破碎（冰上操作）：加30 mL PBS混勻菌體沉淀[2]。（3）超聲：在冰水混合物中進(jìn)行，超聲條件：65%Amp， 超聲3 s，間歇5 s，累計(jì)10 min，超聲后離心：4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清，0.22 μm濾器過濾。（4） SDS電泳檢測(cè)。

1.4.6 過柱純化和超濾 （1）His-S100A16蛋白純化（冰上操作）。（2）稀HCl清洗系統(tǒng)20 min，75%乙醇清洗系統(tǒng) 20 min，水洗系統(tǒng)20 min，綁定5 min，調(diào)節(jié)流速為1 mL/min，連接His-Trap柱，綁定15 min，平衡柱，上樣;過濾，綁定洗雜蛋白20 min，洗脫，接8管，每管1 mL，綁定，加20%乙醇[3]。（3）超濾S100A16蛋白：根據(jù)蛋白電泳的結(jié)果，混合純化的S100A16，用PBS置換buffer（向加入樣品的超濾管中加入PBS，幾乎加滿后離心，保留濾液，洗2次;用考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)蛋白濃度，如果還有蛋白則收集后再次超濾，超濾至考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)蛋白濃度顏色較深為止），收集S100A16蛋白，SDS電泳檢測(cè)S100A16。