付勝勇+劉宏祥+謝鵬+童海兵+徐善金+陳衛(wèi)彬+卜柱

摘要：利用PCR測(cè)序及生物信息學(xué)分析技術(shù)，測(cè)定中國(guó)境內(nèi)8個(gè)品種（系）鴿108份樣本mtDNA D-loop區(qū)部分序列，研究中國(guó)部分肉鴿品種（系）的遺傳多態(tài)性與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明，在擴(kuò)增的761 bp mtDNA D-loop區(qū)序列間發(fā)現(xiàn)3個(gè)變異位點(diǎn)，約占分析位點(diǎn)總數(shù)的0.39，具4個(gè)單倍型;8個(gè)群體內(nèi)單倍型多樣度為0.333～0.867，總體單倍型變異度為0.559，總體核苷酸多樣度為0.000 85，表現(xiàn)出較為貧瘠的遺傳多態(tài)性，未表現(xiàn)出顯著的遺傳分化;石岐鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、銀羽王鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、泰深鴿與銀羽王鴿間呈現(xiàn)出較大的遺傳距離，在后期配套系培育及雜交優(yōu)勢(shì)利用方面具較大遺傳選育空間。

關(guān)鍵詞：鴿;mtDNA D-loop;遺傳多態(tài)性;系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類號(hào)： S836.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0041-03

收稿日期：2014-05-16

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（12）3073];江蘇省揚(yáng)州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)（編號(hào)：yz2011068）;江蘇省蘇北科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：BN2013043）。

作者簡(jiǎn)介：付勝勇（1985—），男，四川內(nèi)江人，碩士，助理研究員，從事家禽營(yíng)養(yǎng)與品種選育研究。E-mail：xnfsy@163.com。

通信作者：卜 柱，碩士，副研究員，從事肉鴿生產(chǎn)與裝備創(chuàng)新研究。E-mail：jsbuzhu@163.com。

高等動(dòng)物的線粒體DNA（mtDNA）為共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小為16 355～16 359 bp，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單穩(wěn)定，由37個(gè)基因和1段D-loop區(qū)（控制區(qū)）組成，符合母系遺傳，不受引進(jìn)品種雜交改良的影響，可以真實(shí)地反映當(dāng)?shù)匚锓N起源[1]。哺乳動(dòng)物及鳥(niǎo)類在mtDNA中進(jìn)化速度最快、多態(tài)性最豐富，在動(dòng)物起源演化、遺傳距離測(cè)算生物地理學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育等方面得到廣泛的應(yīng)用[2]。從已公布的序列來(lái)看，鴿線粒體DNA由17 229對(duì)堿基構(gòu)成[3]，分布有13個(gè)基因位點(diǎn)，其中，第15 573～17 229 bp序列為D-loop區(qū)，全長(zhǎng)1 656 bp。本研究對(duì)中國(guó)鴿mtDNA D-loop區(qū)多態(tài)性及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行取樣分析研究，以推進(jìn)我國(guó)肉鴿的系統(tǒng)選育工作。

1 材料與方法

1.1 材料

石岐鴿和銀羽王鴿血樣各12份，采自廣東省中山市石岐鴿場(chǎng);2002年引自法國(guó)的歐洲肉鴿Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系血樣各12份、源自美國(guó)的白羽王鴿和銀羽王鴿血樣各12份、源自深圳天翔達(dá)祖代種鴿場(chǎng)的卡奴鴿和泰深鴿血樣各12份，均采自江蘇省江陰威特凱鴿業(yè)有限公司。每群體取成年公鴿和母鴿各6羽，共計(jì)8個(gè)品種（系）108份樣本，采用檸檬酸+檸檬酸鈉+葡萄糖（ACD）抗凝靜脈采血1 mL，加入裂解液，4 ℃保存;采用Guo等的方法[4]提取基因組DNA。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_013978）下載鴿子線粒體全序列（登錄號(hào)：NC_013978.1）為參考序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，擴(kuò)增片段覆蓋D-loop區(qū)。引物信息為：F1：5′-TTCCGCTTGGCCTTTCTC-3′，R1：5′-GATGACCGCAATGCCGAA-3′;F2：5′-CTCGACCTCAGGTACTACTGGCGT-3′，R2：5′-ACTTCTGCGGTTCTGCCGGGATGT-3′。

1.3 線粒體DNA D-loop區(qū)擴(kuò)增與序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增體系的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火60 s，72 ℃延伸30 s，38個(gè)循環(huán);72 ℃充分延伸 7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖（美國(guó)FMC）凝膠電泳檢測(cè)其片段大小、純度、亮度，小量膠回收試劑盒回收目的片段;分別取2.5～5.0 μL回收產(chǎn)物，用PCR引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序試劑采用Thermo Sequenase Cycle Squencing Kit（美國(guó)USB公司），按照操作規(guī)程進(jìn)行;委托上海英俊生物測(cè)序公司使用LI-COR 4200 DNA自動(dòng)分析儀（LI-COR Biotechnology Division，Lincoln，NE）進(jìn)行序列分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

擴(kuò)增所得的mtDNA D-loop區(qū)序列用DNA MAN進(jìn)行序列編輯;用Mega軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，DNA SP5.10軟件統(tǒng)計(jì)不同鴿品種（系）mtDNA D-loop區(qū)的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（number of polymorphie sites）、總突變位點(diǎn)數(shù)（total number of mutations）、單倍型數(shù)（number of Haplotypes）、單倍型多樣度（haplotype diversity）、核苷酸多樣性（nueleotide diversity）、平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences）、遺傳距離等;采用鄰接法（Neighbor-Jointing，NJ）最大似然法、最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其中節(jié)點(diǎn)自舉置信水平采用Bootstrap估計(jì)和1 000次循環(huán);用Network軟件分析單倍型演變及分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鴿品種（系）mtDNA D-loop區(qū)單倍型與核苷酸變異

本研究擴(kuò)增并測(cè)定肉鴿部分的D-loop 序列，靠近tRNAPro基因一側(cè)擴(kuò)增片段總長(zhǎng)為761 bp。由表1可見(jiàn)，8個(gè)群體單倍型多樣度為0.333～0.867，總體單倍型變異度為0559，總體核苷酸多樣度為0.000 850;利用Mega分析軟件對(duì)108條mtRNA D-loop區(qū)進(jìn)行同源序列比對(duì)，在8個(gè)鴿品種（系）中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，分別位于第50、第51、第148堿基處;mtRNA D-loop區(qū)序列段由4種單倍體型組成。由圖1和表2可見(jiàn)，單倍型分布頻率以CTC型所占比例最大，為 62.96%，單倍型總數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)以中山石歧鴿和歐洲肉鴿Ⅲ最豐富，涵蓋有全部多態(tài)性位點(diǎn)和單倍型。

表1 不同鴿品種（系）mtDNA D-loop 區(qū)單倍型與核苷酸變異

品種（系） 樣本數(shù)（份） 多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（個(gè)） 單倍型數(shù) 單倍型多樣度 核酸多樣度

石岐鴿 12 3（50 bp，51 bp，148 bp） 4 0.525 0.000 770

銀羽王鴿 24 2（50 bp，51 bp） 3 0.386 0.000 530

歐洲肉鴿Ⅰ 12 1（148 bp） 2 0.667 0.000 880

歐洲肉鴿Ⅱ 12 1（51 bp） 2 0.500 0.000 660

歐洲肉鴿Ⅲ 12 3（50 bp，51 bp，148 bp） 4 0.867 0.000 158

卡奴鴿 12 2（50 bp，148 bp） 3 0.733 0.000 114

白羽王鴿 12 1（148 bp） 2 0.333 0.000 440

泰深鴿 12 1（148 bp） 2 0.533 0.000 700

總和 108 3 4 0.559 0.000 850

2.2 不同鴿品（系）種mtDNA D-loop 區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

由圖2可見(jiàn)，本研究的鴿品種（系）mtDNA D-loop序列

表2 不同鴿品種（系）mtDNA D-loop 區(qū)單倍型分布頻率

名稱 單倍型 樣本數(shù)（份） 頻率（%）

H_1 CTT 19 17.59

H_2 CTC 68 62.96

H_3 CCC 7 6.48

H_4 TTC 14 12.96

大致聚為2個(gè)聚類簇，歐洲肉鴿Ⅰ、Ⅲ和泰深鴿可分為一大類，卡奴鴿、石岐鴿、銀羽王鴿、白羽王鴿等品種（系）可分為另一大類，在系統(tǒng)進(jìn)化上顯現(xiàn)出品種（系）間的血緣關(guān)系遠(yuǎn)近和親疏訊息。

2.3 不同鴿品種（系）間遺傳距離

由表3可見(jiàn)，我國(guó)現(xiàn)存不同鴿品種（系）間遺傳距離變異范圍為0.000 7～0.005 1;石岐鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、銀羽王鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、泰深鴿與銀羽王鴿間距離值較大，分別為 0.004 7、0.005 1、0.004 4;其他品種（系）間距離值相對(duì)較小，變異范圍為0.000 7～0.004 1。

表3 不同鴿品種（系）間kimura雙參數(shù)遺傳距離

品種（系）

遺傳距離

SQ YY OⅠ OⅡ OⅢ KN TS BY

SQ — 0.001 6 0.004 7 0.002 0 0.003 4 0.002 3 0.004 1 0.002 3

YY 0.001 6 — 0.005 1 0.001 8 0.003 4 0.002 2 0.004 4 0.002 2

OⅠ 0.004 7 0.005 1 — 0.003 3 0.002 9 0.002 9 0.000 7 0.002 9

OⅡ 0.002 0 0.001 8 0.003 3 — 0.002 9 0.001 8 0.002 9 0.001 8

OⅢ 0.003 4 0.003 4 0.002 9 0.002 9 — 0.002 9 0.002 9 0.002 9

KN 0.002 3 0.002 2 0.002 9 0.001 8 0.002 9 — 0.002 7 0.001 9

TS 0.004 1 0.004 4 0.000 7 0.002 9 0.002 9 0.002 7 — 0.002 7

BY 0.002 3 0.002 2 0.002 9 0.001 8 0.002 9 0.0019 0.002 7 —

注：SQ、YY、OⅠ、OⅡ、OⅢ、KN、TS、BY分別為石岐鴿、銀羽王鴿、歐洲肉鴿Ⅰ、歐洲肉鴿Ⅱ、歐洲肉鴿Ⅲ、卡奴鴿、泰深鴿、白羽王鴿。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)測(cè)定了8個(gè)鴿品種（系）間共108個(gè)mtDNA D-loop序列，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)變異位點(diǎn)，分別位于第50、第51、第148堿基，占分析總數(shù)的0.39%，所有多態(tài)位點(diǎn)均為兩核苷酸變異;8個(gè)鴿品種（系）間檢測(cè)到4種單倍型，單倍型多樣度為0.559，核苷酸多樣度為0.000 850，多樣性相對(duì)較為匱乏，這與胡永勝等研究結(jié)論[5]不一致，可能是因?yàn)檫x擇的序列區(qū)域與比對(duì)范圍不同。相對(duì)于驢、牦牛、奶山羊、雞等家畜禽[2，6-7]動(dòng)輒成十上百的變異位點(diǎn)而言，我國(guó)現(xiàn)有鴿品種（系）顯現(xiàn)出較為不豐富的遺傳多態(tài)性，這可能與鴿專門化品系選育工作開(kāi)展較晚及鳥(niǎo)類特有的飛翔遷移流動(dòng)性較大有關(guān)。品種（系）選育導(dǎo)致品種間有差異變化的基因突變不能有效留存下來(lái);鳥(niǎo)類特有的飛翔遷移流動(dòng)性導(dǎo)致群體間不能形成有效的環(huán)境、氣候、生態(tài)樣生殖隔離，進(jìn)而閉鎖繁衍出新的類群或亞型，引起自然地域隔離造成生態(tài)多樣性減少[8]。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，本研究中的鴿種群均可追溯于同一母系起源，我國(guó)現(xiàn)存鴿品種（系）大致分為2類，從歐洲引進(jìn)的歐洲肉鴿和泰深鴿為1類，從美國(guó)引進(jìn)的白羽王鴿、銀羽王鴿及地方品種石岐鴿等為另一大類。

石岐鴿是由廣州中山海外僑胞帶回的優(yōu)良種鴿與中山本地優(yōu)良鴿品種進(jìn)行雜交培育而成[8]，距今已有100年歷史。本試驗(yàn)結(jié)果表明，石岐鴿與銀羽王鴿間遺傳距離較小，為0001 6，在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中也與銀羽王鴿同支相連，這說(shuō)明在石岐鴿品種形成過(guò)程中，可能引入了銀羽王鴿血統(tǒng)?？ㄅ澰诿绹?guó)棕櫚鴿場(chǎng)1915年開(kāi)始選育，1932年正式命名，先后導(dǎo)入卡奴鴿與白色賀姆鴿、白羽王鴿和白色侖替鴿等血脈[9]，卡奴鴿與其他各品種（系）間遺傳距離差異較小，主要與其育成過(guò)程有關(guān)。

泰深鴿、歐洲肉鴿屬于歐洲地域品種，而白羽王鴿、卡奴鴿、銀羽王鴿屬于北美地域品種，國(guó)內(nèi)的石岐鴿兼有北美血統(tǒng)和亞洲血統(tǒng)[9]，本研究中遺傳距離參數(shù)測(cè)算分析的結(jié)果與之較為吻合，即相同區(qū)域內(nèi)的鴿品種（系）間遺傳距離較近，不同區(qū)域間鴿品種遺傳距離較遠(yuǎn)。遺傳距離測(cè)算分析表明，石岐鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、銀羽王鴿與歐洲肉鴿Ⅰ、泰深鴿與銀羽王鴿間遺傳距離較遠(yuǎn)，在后期雜交優(yōu)勢(shì)利用、配套系培育方面有較大的遺傳選育空間。

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