劉金濤+范里+鄧獻存+劉旭平+譚文松

摘要：在前期建立的流加培養(yǎng)工藝的基礎上，考察培養(yǎng)過程中的pH值對流加培養(yǎng)過程的影響，明確了過程控制參數(shù)pH值與產(chǎn)品關鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）間的聯(lián)系，建立了產(chǎn)物質(zhì)量屬性和過程操作屬性間的關系，并確認pH值為抗體融合蛋白生產(chǎn)工藝中的關鍵控制參數(shù)。結(jié)果表明，流加培養(yǎng)過程隨著培養(yǎng)pH值的提高，抗體融合蛋白的生物學活性呈一定程度的下降趨勢，但唾液酸含量卻呈明顯的上升趨勢;此外，在pH值6.9和pH值7.0的條件下培養(yǎng)過程中的最大細胞密度、活力、蛋白表達量均優(yōu)于其他條件，確定6.95±0.05為過程的控制pH值。將此培養(yǎng)工藝放到大200 L中試生產(chǎn)規(guī)模，結(jié)果與2 L反應器的結(jié)果基本一致。

關鍵詞：CHO細胞;pH值;抗體融合蛋白;流加培養(yǎng);產(chǎn)品質(zhì)量

中圖分類號： Q813.1+1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0047-03

收稿日期：2014-12-21

基金項目：國家自然科學基金（編號：21106045）。

作者簡介：劉金濤（1987—），男，山東臨沂人，博士研究生，主要從事動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究。E-mail：jtliu0416@gmail.com。

通信作者：譚文松，教授，博士生導師，主要從事動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究。E-mail：wstan@ecust.edu.cn。

抗體藥物由于具有靶點明確、臨床療效顯著、副作用少等優(yōu)點已成為當今生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主流，其中動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是生產(chǎn)抗體藥物最主要的技術(shù)手段?！百|(zhì)量可控，安全有效”是藥品研發(fā)過程中應首要遵循的原則，美國FDA在21世紀現(xiàn)行優(yōu)良生產(chǎn)規(guī)范（current good manufacturing practices，cGMPs）中提出的一個關鍵要素就是質(zhì)量源于設計（quality by design，QbD）[1]。因此在工藝開發(fā)中始終貫徹QbD原理，設計不同的參數(shù)控制范圍來設計產(chǎn)品的質(zhì)量，使得產(chǎn)品質(zhì)量始終處于可控狀態(tài)，對加快藥品開發(fā)有著十分重要的意義[2]。

前期我們關于培養(yǎng)溫度對細胞生長和產(chǎn)物表達影響及機制進行了深入的研究和探討[3-4]，而培養(yǎng)過程中的另一關鍵控制參數(shù)——pH值對細胞生長和表達有著重要作用[5]。一方面由于pH值在搖瓶、孔板等小規(guī)模培養(yǎng)高通量系統(tǒng)中難以進行有效的檢測和控制，導致在放大到反應器規(guī)模時則會出現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量不可控制的狀態(tài);另一方面細胞在培養(yǎng)過程中乳酸等代謝副產(chǎn)物的大量生成導致培養(yǎng)體系中的pH值發(fā)生較大變化，須要通過補酸或補堿的方式維持pH值的穩(wěn)定。因此在反應器中系統(tǒng)研究pH值對于細胞生理狀態(tài)特別是產(chǎn)物質(zhì)量的影響是保證生產(chǎn)過程中產(chǎn)品質(zhì)量可控的一項必不可少的工作。

本研究以表達抗體的融合蛋白的重組中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞為研究對象，以抗體融合蛋白關鍵質(zhì)量參數(shù)為主要評價標準，同時結(jié)合細胞生長、代謝和產(chǎn)物表達情況，在2 L生物反應器中對流加培養(yǎng)過程中的操作參數(shù)pH值進行了詳細的考察，通過綜合分析確定最適pH值，并成功地將該工藝穩(wěn)定地放大到中試生產(chǎn)規(guī)模。

1 材料與方法

1.1 細胞株和培養(yǎng)基

試驗細胞株為表達抗體融合蛋白的重組CHO細胞?；A培養(yǎng)基為商業(yè)Excell 302培養(yǎng)基（SAFC），流加培養(yǎng)基為筆者實驗室自主開發(fā)[6]。培養(yǎng)基經(jīng)0.22 μm微孔濾膜（millipore）過濾除菌，保存于4 ℃冰箱。培養(yǎng)基配制所用試劑均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

從細胞庫中復蘇重組CHO細胞，以（2～3）×105 個/mL活細胞密度接種于搖瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min，作為試驗用的種子細胞。取對數(shù)生長期的CHO細胞，以約1.0×106 個/mL的活細胞密度接種至反應器中，培養(yǎng)體積為1.5 L。培養(yǎng)過程中每24 h取樣，計數(shù)。培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min離心10 min后取上清于-20 ℃保存，用于試驗結(jié)束后營養(yǎng)物、代謝副產(chǎn)物、抗體融合蛋白的檢測。培養(yǎng)過程均使用Sartorius公司生產(chǎn)的2 L BIOSTAT A-plus 細胞反應器。培養(yǎng)時反應器操作條件：溶解氧為50%，溫度為 37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH值分別控制在6.8、6.9、70、7.2條件下（無控制作用區(qū)設為±0.02）。pH值的控制采用深層通入CO2或者補入1 mol/L NaOH 溶液的方式。流加策略采用葡萄糖控制模型[6]。

1.3 分析方法

細胞密度和活力采用Bio-Rad TC20TM 自動計數(shù)儀，葡萄糖、乳酸、氨的檢測采用 NOVA Bioprofile 400;產(chǎn)物濃度的檢測采用 Protein A-HPLC （Applied Biosystems）的方法，方法參照文獻[7]。上清收獲后采用rProtein A親和層析柱（GE Healthcare）純化并收集抗體。唾液酸含量根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2010年版3部）中唾液酸檢測方法測定。生物學活性的測定方法同文獻[8]。多聚體的檢測采用凝膠排阻色譜（SEC）的方法，色譜柱為TSK-Gel G3000 SWXL （4.6 mm×30 cm，Tosoh Bioscience），方法參見文獻[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對于細胞生長和代謝的影響

2.1.1 pH值對細胞生長的影響 通過在不同pH值培養(yǎng)條件（6.8、6.9、7.0、7.2）下的對比試驗可知，在pH值6.8條件下，CHO細胞直接進入指數(shù)生長期，快速生長達到最高細胞密度 8.6×106 個/mL，隨后活細胞密度顯著降低（圖1）。pH值6.9 和pH值7.0的條件下，細胞生長情況與pH值6.8條件下類似，但最高活細胞密度達到1.01×107 個/mL，并且至培養(yǎng)結(jié)束時細胞仍維持較高的活力（大于90%）。而在pH值7.2的條件下最高活細胞密度僅為5.8×106 個/mL，隨后活細胞密度和細胞活力快速下降，培養(yǎng)僅維持9 d，培養(yǎng)結(jié)束時細胞活力僅為45.7%。

2.1.2 pH值對主要營養(yǎng)物表達的影響 葡萄糖是細胞生長代謝所需的重要碳源和能源物質(zhì)，為了維持培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，防止葡萄糖耗竭所引起的細胞代謝的變化[10]，流加策略采用葡萄糖控制模型。由表1可知，在細胞生長階段（0～5 d）各培養(yǎng)過程的葡萄糖比消耗速率無明顯差異。而產(chǎn)物表達階段（6～12 d），pH值控制在7.2的培養(yǎng)過程葡萄糖的比消耗速率依然維持在一個較高的水平，為1.8 mmol/（109cells·d），是其他培養(yǎng)過程的3.3～3.8倍。

乳酸和氨是細胞代謝的2個主要副產(chǎn)物，在培養(yǎng)基中的大量累積會嚴重影響細胞的生長和產(chǎn)物的表達[11-12]。與其他培養(yǎng)過程中出現(xiàn)乳酸代謝轉(zhuǎn)變現(xiàn)象不同，pH值為7.2的培養(yǎng)過程乳酸仍一直處于生成狀態(tài)，培養(yǎng)結(jié)束時培養(yǎng)基中的乳

表1 流加培養(yǎng)過程中主要營養(yǎng)物及代謝副產(chǎn)物比消耗（生成）速率

pH值

比消耗速率[mmol/（109cells·d）]

葡萄糖 乳酸 氮

0～5 d 6～12 d 0～5 d 6～12 d 0～5 d 6～12 d

6.8 -2.40 -0.54 1.75 -0.43 0.44 0.27

6.9 -2.25 -0.50 2.05 -0.24 0.42 0.12

7.0 -2.35 -0.47 1.98 -0.08 0.49 0.05

7.2 -2.31 -1.80 2.61 0.82 0.45 0.054

注：負值代表消費。

酸濃度達到了44.8 mmol/L，是其他過程的1.48～3.33倍（圖2-A）。培養(yǎng)過程中乳酸的大量累積可能是導致pH值為7.2時培養(yǎng)過程活細胞密度和細胞活力快速下降的主要原因。與乳酸代謝相似，氨代謝也在培養(yǎng)至4 d出現(xiàn)了顯著的區(qū)別（圖2-B）。氨在pH值為6.9～7.2的培養(yǎng)過程進行到4 d后累積速率顯著降低，以pH值為7.0的培養(yǎng)過程為例，氨比生成速率從0.49降低至0.05（表1），而pH值為6.8的培養(yǎng)過程氨依然大量累積，培養(yǎng)結(jié)束時氨濃度達到 17.7 mmol/L。

2.2 pH值對抗體融合蛋白表達以及產(chǎn)品質(zhì)量的影響

2.2.1 pH值對抗體融合蛋白表達的影響 由表2可知，在pH 值7.2條件下，由于細胞生長和維持不利，抗體融合蛋白的最高濃度僅為0.32 g/L，僅是pH值在7.0培養(yǎng)過程的24%。對比不同條件下抗體融合蛋白的比生成速率，pH值7.2條件下抗體融合蛋白比生成速率與pH值7.0培養(yǎng)過程相比分別下降了63.1%、20.7%。

2.2.2 pH值對抗體融合蛋白唾液酸含量的影響 唾液酸廣泛存在于糖蛋白N-糖鏈或O-糖鏈的末端，研究表明，蛋白類藥物中唾液酸含量對于藥物在體內(nèi)的半衰期有著重要的影響[13]。因此抗體融合蛋白的唾液酸化程度是衡量藥用蛋白質(zhì)量的一個重要指標。在不同pH值培養(yǎng)條件下抗體融合蛋

表2 pH值對抗體融合蛋白生成的影響

pH值 表達量

（g/L） 蛋白比生成速率

[pg（cell·d）]

6.8 0.90 17.8

6.9 1.28 17.2

7.0 1.35 17.9

7.2 0.32 14.2

白的唾液酸含量見圖3-A，可見隨著培養(yǎng)pH值的降低抗體融合蛋白的唾液酸含量呈明顯下降趨勢，在pH值6.8條件下的唾液酸含量僅為pH值7.0條件下的73.5%。研究結(jié)果表明，降低培養(yǎng)過程中的pH值能夠顯著抑制抗體融合蛋白的唾液酸修飾。Gawlitzek等在研究氨對TNFR-Fc影響時發(fā)現(xiàn)，提高培養(yǎng)基中氨的濃度（15 mmol/L）能顯著降低蛋白的唾液酸含量[14]。研究還表明，降低培養(yǎng)pH值能使氨的比生成速率顯著提高，這可能是在pH值6.8條件下唾液酸含量下降的主要原因。

抗體融合蛋白的生物學活性是評價產(chǎn)品生物學性質(zhì)的一個重要指標。隨著培養(yǎng)過程中pH值的提高，抗體融合蛋白的生物學活性呈明顯下降趨勢。在pH值7.2的條件下，抗體融合蛋白的生物學活性僅為pH值7.0條件下的45.1%（圖3-B）?？赡苁怯捎谂囵B(yǎng)pH值改變引起了胞內(nèi)pH值的改變，影響了抗體融合蛋白的加工和修飾過程中酶活性的變化，從而影響了蛋白的翻譯后修飾。

2.2.3 pH值對抗體融合蛋白多聚體含量的影響 重組蛋白的聚合是影響重組蛋白質(zhì)量、安全的主要因素之一，不僅影響其生物學功能，而且有可能在體內(nèi)引起免疫反應[15]。不同pH值條件下培養(yǎng)液中抗體融合蛋白單體和多聚體的含量見表3。結(jié)果表明，pH值為6.9的培養(yǎng)過程抗體融合蛋白多聚體含量最低，僅為5.87%，升高或降低pH值水平多聚體含量略有增加。考慮到多聚體的含量仍處于較高水平，可以進一步優(yōu)化培養(yǎng)工藝或者通過下游純化的方法來進一步降低多聚

表3 不同pH值條件下抗體融合蛋白多聚體含量

pH值

融合蛋白（%）

多聚體 單體

6.8 7.51 92.49

6.9 5.87 94.13

7.0 6.59 93.41

7.2 7.89 92.11

體的含量。

2.3 流加培養(yǎng)工藝的優(yōu)化及放大

通過研究，明確了過程控制參數(shù)pH值與產(chǎn)品關鍵質(zhì)量控制參數(shù)唾液酸、多聚體含量、產(chǎn)物生物學活性間的聯(lián)系，建立了產(chǎn)物質(zhì)量屬性和過程操作屬性間的關系，確認pH值為抗體融合蛋白生產(chǎn)工藝中的關鍵控制參數(shù)。研究結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)pH值的提高，抗體融合蛋白的生物學活性呈一定程度的下降趨勢，但是抗體融合蛋白的唾液酸含量卻呈明顯的上升趨勢。在pH值6.9和pH值7.0的條件下，培養(yǎng)過程中的最大細胞密度、活力以及蛋白表達量均優(yōu)于其他條件。綜合考慮抗體融合蛋白的各個質(zhì)量指標、細胞的生長和表達情況以及反應器控制時pH值的波動問題，在培養(yǎng)過程中pH值應該控制在6.95±0.05。超過此范圍特別是pH值水平偏高達7.2時，細胞生長受到抑制且維持不利，乳酸大量生成，關鍵質(zhì)量控制參數(shù)唾液酸和產(chǎn)物活性均有不同程度的降低。

通過培養(yǎng)pH值的優(yōu)化，并將流加培養(yǎng)工藝放大到30 L和200 L規(guī)模的反應器，表現(xiàn)結(jié)果與2 L反應器下的結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

在前期流加培養(yǎng)工作的基礎上，通過考察流加培養(yǎng)過程中培養(yǎng)pH值對細胞生長、代謝與產(chǎn)物合成以及產(chǎn)物各質(zhì)量參數(shù)的影響，結(jié)果表明：（1） 在pH值6.9和pH值7.0的條件下，最大細胞密度和細胞活力以及抗體融合蛋白的表達量均高于其他培養(yǎng)條件;（2） 培養(yǎng)過程中的pH值對細胞的乳酸或氨代謝有較顯著的影響;（3） 提高培養(yǎng)過程中的pH值，抗體融合蛋白的生物學活性呈顯著下降趨勢，而抗體融合蛋白的唾液酸含量卻呈上升趨勢。

將細胞生長、代謝、表達以及抗體融合蛋白的各質(zhì)量參數(shù)綜合比對分析，確定6.95±0.05為過程的控制pH值，并成功放大到30 L和200 L反應器規(guī)模。試驗還發(fā)現(xiàn)抗體融合蛋白的多聚體含量仍處于較高的水平，可以進一步通過優(yōu)化培養(yǎng)基、改變培養(yǎng)參數(shù)或者下游分離純化等方法降低抗體融合蛋白的多聚體含量。

參考文獻：

[1]Yu L X. Pharmaceutical quality by design：Product and process development，understanding，and control[J]. Pharmaceutical Research，2008，25（4）：781-791.

[2]Rathore A S，Winkle H. Quality by design for biopharmaceuticals[J]. Nature Biotechnology，2009，27（1）：26-34.

[3]Kou T C，F(xiàn)an L，Zhou Y，et al. Detailed understanding of enhanced specific productivity in Chinese hamster ovary cells at low culture temperature[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，111（3）：365-369.

[4]Kou T C，F(xiàn)an L，Zhou Y，et al. Increasing the productivity of TNFR-Fc in GS-CHO cells at reduced culture temperatures[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2011，16（1）：136-143.

[5]Gawlitzek M，Estacio M，F(xiàn)urch T，et al. Identification of cell culture conditions to control N-glycosylation site-occupancy of recombinant glycoproteins expressed in CHO cells[J]. Biotechnology and Bioengineering，2009，103（6）：1164-1175.

[6]范 里，趙 亮，孫亞婷，等. 表達TNFR-Fc融合蛋白的 GS-CHO 細胞動態(tài)流加培養(yǎng)過程的設計[J]. 生物工程學報，2010，26（2）：216-222.

[7]Yang J D，Lu C H，Stasny B，et al. Fed-batch bioreactor process scale-up from 3 L to 2 500 L scale for monoclonal antibody production from cell culture[J]. Biotechnology and Bioengineering，2007，98（1）：141-154.

[8]Tan Q Q，Guo Q C，F(xiàn)ang C，et al. Characterization and comparison of commercially available TNF receptor 2-Fc fusion protein products[J]. mAbs，2013，4（6）：761-774.

[9]Gomez N，Subramanian J，Ouyang J，et al. Culture temperature modulates aggregation of recombinant antibody in cho cells[J]. Biotechnology and Bioengineering，2012，109（1）：125-136.

[10]劉國慶，陳 飛，趙 亮，等. 表達單克隆抗體的CHO細胞無蛋白培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 高?；瘜W工程學報，2013，27（1）：96-101.

[11]Newland M，Kamal M N，Greenfield P F，et al. Ammonia inhibition hybridomas propagated in batch，fed-batch，and continuous-culture[J]. Biotechnology and Bioengineering，1994，43（5）：434-438.

[12]Li J C，Wong C L，Vijayasankaran N A，et al. Feeding lactate for CHO cell culture processes：Impact on culture metabolism and performance[J]. Biotechnology and Bioengineering，2012，109（5）：1173-1186.

[13]Weiss P，Ashwell G. The asialoglycoprotein receptor：properties and modulation by ligand[J]. Progress in Clinical and Biological Research，1989，300：169-184.

[14]Gawlitzek M，Ryll T，Lofgren J，et al. Ammonium alters N-glycan structures of recombinant TNFR-IgG：Degradative versus biosynthetic mechanisms[J]. Biotechnology and Bioengineering，2000，68（6）：637-646.

[15]Rosenberg S A. Effects of protein aggregates：an immunologic perspective[J]. AAPS Journal，2006，8（3）：501-507.