楊名方+張崇玉+付責(zé)中+秦仕華

摘要：通過(guò)大田試驗(yàn)，以探明大豆根瘤類菌體生長(zhǎng)隨播種時(shí)間的變化趨勢(shì)，以及施用有機(jī)肥作為基肥、配施鉬肥和鐵肥與大豆種植密度等因素對(duì)大豆根瘤菌產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，在播種后40～90 d，大豆根瘤菌粒數(shù)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均隨播種時(shí)間呈先增加后降低的趨勢(shì)，其最大值均出現(xiàn)在播種后70 d左右，此時(shí)大豆剛剛進(jìn)入結(jié)莢期;有機(jī)肥作為基肥對(duì)根瘤菌的產(chǎn)生影響最大，其后依次是鉬肥、種植密度、鐵肥;根瘤菌產(chǎn)量最高的組合是不施有機(jī)肥與鉬肥，鐵肥施肥量為150 g/hm2，大豆撒播密度為1.5×107 株/hm2。

關(guān)鍵詞：大豆;根瘤菌;播種時(shí)間;鉬肥;鐵肥;種植密度

中圖分類號(hào)： S565.104;Q945.13 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0105-03

收稿日期：2014-10-06

作者簡(jiǎn)介：楊名方（1987—），女，碩士，從事施肥原理與養(yǎng)分管理研究。E-mail：461810510@qq.com。

通信作者：張崇玉，博士，教授，從事植物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境科學(xué)研究。E-mail：zhcy600116@sina.com。

生物固氮是指固氮微生物將空氣中游離態(tài)的氮素轉(zhuǎn)變?yōu)榘睉B(tài)氮，并能被植物吸收利用的過(guò)程。目前，人類對(duì)豆科植物的共生固氮利用空間還很大[1]，如何使非豆科植物特別是主要糧食作物具有固氮作用更是人們正在努力探索的方向[2]，原生態(tài)根瘤菌產(chǎn)品的工業(yè)化具有廣闊的市場(chǎng)前景。對(duì)根瘤類菌體產(chǎn)生的適宜條件開(kāi)展研究，可以增強(qiáng)人們對(duì)生物固氮的認(rèn)識(shí)，對(duì)通過(guò)種植原生態(tài)大豆為微生物肥料生產(chǎn)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)的原始根瘤菌群具有重大意義[3]。

在大豆-根瘤共生體系中，根瘤為大豆提供了氮源，同時(shí)可從寄主植株吸收養(yǎng)分供自身生長(zhǎng)。有研究表明，通過(guò)施肥等方式可使寄主植物地上部分營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)增加、新陳代謝增強(qiáng)，但同時(shí)也減少了光合產(chǎn)物向地下部分運(yùn)輸，影響了根瘤的生長(zhǎng)[4]。固氮酶能讓固氮微生物在常溫下將氮?dú)夥肿愚D(zhuǎn)化為氨，并可進(jìn)一步分化為鉬鐵蛋白和鐵蛋白2個(gè)大小不同的深褐色蛋白，且只有在2個(gè)蛋白處于結(jié)合狀態(tài)的時(shí)候才具有催化活性，鉬鐵元素對(duì)固氮酶具有十分重要的作用。氧氣對(duì)固氮酶極易產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞，既破壞固氮酶的活性，又破壞固氮酶的生物合成，對(duì)生物固氮本身非常有害，固氮酶中的鐵蛋白對(duì)氧尤其靈敏[5]。

在寄主豆科植物幼苗長(zhǎng)出2～3片真葉時(shí)，根瘤菌首先進(jìn)入根毛，經(jīng)過(guò)1條“侵入線”進(jìn)入皮層細(xì)胞并立即被質(zhì)膜包圍，在形成的包膜中繁殖、發(fā)育為成熟的類菌體。在這個(gè)系統(tǒng)中，豆血紅蛋白、膜和末端氧化酶系統(tǒng)共同創(chuàng)造了一個(gè)既能保護(hù)固氮酶的活力，又能有效利用的低濃度氧環(huán)境，使生物固氮能夠在類菌體中進(jìn)行[6]。本試驗(yàn)通過(guò)施用有機(jī)肥作為基肥提供氮、磷、鉀等主要營(yíng)養(yǎng)元素，施用不同質(zhì)量的鉬肥和鐵肥，設(shè)置不同的大豆種植密度以影響寄主植株的通風(fēng)透光性等，觀察和分析根瘤類菌體的產(chǎn)生情況，并通過(guò)正交試驗(yàn)，獲得根瘤類菌體產(chǎn)生條件的優(yōu)化組合。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院松林坡試驗(yàn)地（SLP）大田進(jìn)行，土壤pH值為7.65，全氮、有機(jī)質(zhì)含量分別為1.97、18.26 g/kg，堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為11.2、30.1、407.24 mg/kg;選取貴陽(yáng)市花溪區(qū)農(nóng)戶自留的大豆種為試材，以撒播方式進(jìn)行種植。大豆基肥為實(shí)驗(yàn)室專用有機(jī)肥，其養(yǎng)分含量為全氮0.92%、有效磷（P2O5）2.69%、有效鉀（K2O）0.98%;鉬酸銨試劑由洛陽(yáng)歐瑞冶金科技有限公司生產(chǎn)，氧化鉬含量為83.19%，用以配制鉬肥;硫酸亞鐵由天津市永大化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，硫酸亞鐵含量為99.0%，用以配制鐵肥。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 根瘤菌收獲時(shí)間的篩選 對(duì)根瘤菌收獲時(shí)間的篩選采用單因素試驗(yàn)，不施用任何肥料，大豆種植密度為1.5×107 株/hm2。重復(fù)3次。

1.2.2 施肥因素與種植密度的篩選 根據(jù)大豆根瘤菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)元素和大豆生長(zhǎng)對(duì)種植密度的要求[7]，選取有機(jī)肥（A）、鉬肥（B）、鐵肥（C）、種植密度（D）為考察因素，按照 L9（34） 正交表（表1）進(jìn)行試驗(yàn)，共計(jì)9個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。有機(jī)肥和鉬肥在播種前撒施，鐵肥于大豆播種25 d左右噴施于葉面上[8]。

1.3 試驗(yàn)處理

每1小區(qū)為1個(gè)處理，面積為3 m2（2 m×1.5 m）。大豆于4月20日播種，播后40 d開(kāi)始采樣，至播后90 d止，每隔4～5 d采樣1次，采樣時(shí)，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取大豆10株，根部隨同泥土一起迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，以根瘤菌粒數(shù)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量作為測(cè)試指標(biāo)，記錄數(shù)據(jù)。正交試驗(yàn)以播后70 d的根瘤菌粒數(shù)和干質(zhì)量各50%權(quán)重進(jìn)行計(jì)算來(lái)作為根瘤菌的產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Excel 2007和DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

處理 A：有機(jī)肥

（t/hm2） B：鉬肥

（g/hm2） C：鐵肥

（g/hm2） D：種植密度

（×106株/ hm2） 代號(hào)

1 0 0 0 5 A1B1C1D1

2 0 150 150 15 A1B2C2D2

3 0 300 225 25 A1B3C3D3

4 1.3 0 150 25 A2B1C2D3

5 1.3 150 225 5 A2B2C3D1

6 1.3 300 0 15 A2B3C1D2

7 2.6 0 225 15 A3B1C3D2

8 2.6 150 0 25 A3B2C1D3

9 2.6 300 150 5 A3B3C2D1

2 結(jié)果與分析

2.1 播種時(shí)間對(duì)大豆根瘤菌粒數(shù)和質(zhì)量的影響

根瘤菌與大豆形成共生關(guān)系，其產(chǎn)生的瘤數(shù)、質(zhì)量均會(huì)隨大豆生理周期的變化而發(fā)生變化。由圖1可知，隨播種天數(shù)的增加，根瘤菌的粒數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì);在播后40～50 d，根瘤菌粒數(shù)呈上升趨勢(shì)，50～60 d，根瘤菌粒數(shù)變化比較平穩(wěn);60～70 d粒數(shù)再次增加，在70 d時(shí)達(dá)到最大值;70～90 d，結(jié)瘤數(shù)逐漸減少。

由圖2可知，根瘤菌的質(zhì)量隨播種時(shí)間的變化趨勢(shì)與粒數(shù)相似，在播種40～70 d不斷增加并達(dá)到最大值，70～90 d逐漸下降;鮮質(zhì)量的變化幅度大于干質(zhì)量的變化幅度。

在大豆-根瘤共生體系中，大豆與根瘤菌的共生固氮作用所固定的氮素占大豆一生需氮量的50%～60%[9]，而根瘤的生長(zhǎng)需要依靠寄主植物提供養(yǎng)分才能完成。從大豆的生長(zhǎng)周期來(lái)看，在播后70 d左右大豆處于結(jié)莢期，并從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，此時(shí)，根瘤菌的活性逐漸降低;播后90 d，大豆種子進(jìn)入成熟期，植株逐漸枯萎，根瘤體系也隨之消亡[10]。隨著活性的降低，根瘤菌群抵抗外界干擾的能力降低，會(huì)受到土壤中其他微生物的侵襲，出現(xiàn)大量壞爛和空殼的現(xiàn)象。因此，在大豆開(kāi)始結(jié)莢以后，根瘤菌的數(shù)量和質(zhì)量均呈現(xiàn)減少和下降的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，為了獲得較高產(chǎn)量的根瘤菌，需在大豆剛剛開(kāi)始進(jìn)入生殖生長(zhǎng)的時(shí)期進(jìn)行收集。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)各因素重要性分析 由表2、表3、表4可知，最優(yōu)組合為A1B1C2D2，即不施用有機(jī)肥和鉬肥，鐵肥施肥量為150 g/hm2、大豆種植密度為 1.5×107株/hm2;試驗(yàn)因素主次順序?yàn)椋篈>B>D>C，即影響因素最大的是有機(jī)肥作為基肥的施肥濃度，其次是鉬肥、大豆種植密度，影響因素最小的是施用鐵肥濃度。

表2 大豆施肥因素與種植密度等正交試驗(yàn)結(jié)果

小區(qū)代號(hào)

根瘤菌粒數(shù)（粒） 根瘤菌干質(zhì)量（g）

重復(fù)1 重復(fù)2 重復(fù)3 重復(fù)1 重復(fù)2 重復(fù)3

A1B1C1D1 157 153 128 0.878 3 0.965 5 0.827 9

A1B2C2D2 145 163 149 0.773 9 1.321 5 0.989 2

A1B3C3D3 79 92 71 0.483 0 0.567 3 0.526 4

A2B1C2D3 81 80 72 0.470 3 0.576 6 0.331 7

A2B2C3D1 70 110 82 0.560 6 0.698 0 0.537 7

A2B3C1D2 46 42 62 0.280 2 0.294 7 0.475 1

A3B1C3D2 83 66 57 0.524 6 0.517 3 0.500 7

A3B2C1D3 27 51 34 0.294 7 0.361 4 0.337 9

A3B3C2D1 37 55 52 0.174 5 0.383 6 0.324 1

表3 不同施肥及種植密度下根瘤菌的產(chǎn)量與極差分析

試驗(yàn)小區(qū) 有機(jī)肥

（t/hm2） 鉬肥

（g/hm2） 鐵肥

（g/hm2） 種植密度

（株/hm2） 干質(zhì)量

（g） 粒數(shù)

（粒） 綜合

評(píng)分

A1B1C1D1 1 1 1 1 0.891 146 73.445

A1B2C2D2 1 2 2 2 1.028 152 76.581

A1B3C3D3 1 3 3 3 0.526 81 40.596

A2B1C2D3 2 1 2 3 0.460 78 39.063

A2B2C3D1 2 2 3 1 0.599 87 43.966

A2B3C1D2 2 3 1 2 0.350 50 25.175

A3B1C3D2 3 1 3 2 0.514 69 34.590

A3B2C1D3 3 2 1 3 0.331 48 24.166

A3B3C2D1 3 3 2 1 0.294 37 18.647

k1 63.541 49.033 40.929 45.353

k2 36.068 48.238 44.764 45.449

k3 25.801 28.139 39.717 34.608

R 37.740 20.894 5.047 10.841

注：統(tǒng)計(jì)分析使用LSD分析法。

表4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)大豆根瘤菌產(chǎn)量方差分析

方差來(lái)源 偏差平方和 自由度 F值 P值

A：有機(jī)肥 2 284.441 2 2.687 >0.05

B：鉬肥 841.106 2 0.989 >0.05

C：鐵肥 41.640 2 0.049 >0.05

D：種植密度 232.963 2 0.274 >0.05

試驗(yàn)結(jié)果表明，不施用有機(jī)肥比施用1.3、2.6 t/hm2有機(jī)肥的根瘤菌產(chǎn)量分別高出76.2%和150.9%;施用 150 g/hm2 鉬肥的大豆根瘤菌產(chǎn)量比不施用鉬肥增加2.1%，比施用300 g/hm2鉬肥產(chǎn)量增加32.9%;大豆種植密度為 15×107株/hm2 時(shí)根瘤菌產(chǎn)量比種植密度為5×106株/hm2時(shí)增產(chǎn)2.2%，比2.5×107株/hm2增產(chǎn)31.3%。鐵肥在大豆播后25 d左右噴施時(shí)遭遇雨水天氣，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果存在較大的誤差，沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行分析。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，大豆收獲根瘤的最佳時(shí)間是播種后70 d左右，此時(shí)，大豆根瘤菌的粒數(shù)和質(zhì)量均達(dá)到最大值。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于大豆品種、生長(zhǎng)特性、地理環(huán)境、氣候等因素的不同而導(dǎo)致播種時(shí)間會(huì)有所不同，可以通過(guò)形態(tài)觀察，在大豆植株剛開(kāi)始進(jìn)入結(jié)莢期、進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)作為根瘤菌的最佳收獲期。大豆僅靠自身的固氮作用不能滿足豐產(chǎn)要求[11-12]，需要通過(guò)施用有機(jī)肥為大豆生長(zhǎng)補(bǔ)充氮、磷、鉀等主要營(yíng)養(yǎng)元素。

氮元素對(duì)豆科植物生物固氮的共生體系產(chǎn)生重大影響[13-21]。在供試土壤條件下，為獲得較高產(chǎn)量的大豆根瘤菌，種植大豆過(guò)程不需要施用肥料，土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可通過(guò)大豆吸收來(lái)滿足根瘤菌的生長(zhǎng)。施用有機(jī)肥可給大豆植株直接提供豐富的氮源，但使大豆對(duì)根瘤中固氮酶提供的氮源依賴性減小，根瘤與大豆的共生關(guān)系遭到破壞[10]。植物的磷吸收與根系形狀、結(jié)瘤數(shù)量、籽粒產(chǎn)量等均有密切關(guān)系[22-23];鉬、鐵是生物固氮體系的重要元素，對(duì)根瘤生長(zhǎng)具有重大的意義[5，8，24]。只有在根瘤菌群中固氮菌數(shù)量和活性均處于較好狀態(tài)時(shí)，營(yíng)養(yǎng)元素才能為根瘤的產(chǎn)量作出較大貢獻(xiàn)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜大豆結(jié)瘤的最佳種植密度是 1.5×107株/hm2，約是通常大豆種植密度的1.5倍，這可能與根瘤菌群的需氧性有關(guān)。根瘤菌結(jié)瘤需要相對(duì)密封的狀態(tài)，通過(guò)適當(dāng)密植，可以減少植株間的通風(fēng)透光性，為根瘤菌的產(chǎn)生提供適當(dāng)封閉的空間。同時(shí)，不施肥與適當(dāng)密植，都適當(dāng)減少了地上部分光合作用和呼吸作用的強(qiáng)度，使根瘤菌能夠從寄主植物獲得更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給菌群的生長(zhǎng)，而種植密度過(guò)大，影響了大豆植物的正常生長(zhǎng)，不利于根瘤的產(chǎn)生。通過(guò)種植大豆收獲根瘤的原始菌群，讓大豆接近“野生狀態(tài)”，利于根瘤菌類菌體的產(chǎn)生，可滿足工業(yè)化生產(chǎn)的較大需求，且操作簡(jiǎn)便。

在本試驗(yàn)中，鐵肥在噴施后受雨水天氣影響，結(jié)果存在較大誤差，有必要對(duì)鐵肥因素進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，本研究只從根瘤菌的產(chǎn)量等相關(guān)方面進(jìn)行了分析，還需要從根瘤菌的菌群種類和固氮菌所占比例及活性等進(jìn)行分析比較，為篩選適宜根瘤菌生長(zhǎng)的環(huán)境條件提供更全面的科學(xué)依據(jù)。

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