趙元增,楊靖,孫海燕

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

不同激素配比對太行菊不定芽增殖與生長的影響

趙元增,楊靖,孫海燕

（河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003）

以太行菊無菌不定芽為材料,改良MS（KNO3與KH2PO4用量加倍,其他成分維持不變）為基本培養(yǎng)基,通過添加不同種類（6-BA、NAA、KT、IBA）與用量的植物激素,研究了不同植物激素配比對太行菊不定芽增殖和生長的影響.結果表明：細胞分裂素6-BA較KT,生長素NAA較IBA更適宜太行菊不定芽的增殖與生長培養(yǎng)；培養(yǎng)基中6-BA與NAA不同質量濃度的組合對太行菊不定芽的增殖與生長產生較大的影響,當配以0.05 mg/L的NAA時,0.2 mg/L的6-BA較適宜太行菊不定芽的分化與增殖,而0.1 mg/L的6-BA較適合太行菊不定芽的生長和小苗的形成.

太行菊；不定芽；離體培養(yǎng)；增殖系數(shù)；植物激素

太行菊[Opisthopappus taihangensis（Ling）Shih]是菊科太行菊屬多年生宿根草本植物,多生長于太行山區(qū)海拔1 000 m左右的懸崖峭壁、陡坡、裸露巖石的石縫中,生境險峻,土壤貧瘠,人常難以到達[1].由于分布區(qū)域狹窄,生境獨特,繁殖能力弱,加之人為的私挖濫采,太行菊現(xiàn)處于瀕危狀態(tài),已被列為國家珍稀瀕危保護植物及河南省重點保護植物[2].與傳統(tǒng)藥用野菊相比,太行菊具有更好的保健或藥用功效,其整株的開發(fā)利用潛力巨大[3-4].另外,作為菊花的野生近緣種,太行菊也是菊花雜交育種理想的材料[5].

近年來,出于對太行菊資源保護與綜合開發(fā)的需要,對太行菊的遺傳多樣性[6-7]、生殖生物學[8-11]、遠緣雜交[12-16]等的研究和報道日趨增多.但對太行菊離體繁殖領域的研究較少,僅見姚連芳等[17]、王建博等[18]、趙元增等[19-20]的少數(shù)報道.在這些有關太行菊組培的報道中,研究內容主要涉及太行菊外植體滅菌方法、愈傷組織誘導與分化、生根培養(yǎng)、基本培養(yǎng)基組成調整等問題[17-20],而植物激素對太行菊不定芽增殖與生長影響的研究,目前尚未見報道.不定芽的擴繁是太行菊組培苗工廠化生產中的關鍵環(huán)節(jié),直接決定著生產的效率與成敗,加深此環(huán)節(jié)的研究,是建立太行菊高效繁育體系的基礎.

本文以太行菊離體不定芽為材料,以改良的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基[19],研究了不同激素種類與用量對太行菊不定芽增殖與生長的影響,以便建立有效的太行菊離體繁殖技術體系,為太行菊種質資源的保護和開發(fā)利用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

太行菊采自新鄉(xiāng)市關山國家地質公園,接種材料為太行菊無菌不定芽.KNO3、KH2PO4、蔗糖、瓊脂粉等藥品或試劑均購自上海晶純生化科技股份有限公司,其中外源激素類試劑為細胞培養(yǎng)級,其他試劑均為分析純（AR）.

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基以改良的MS培養(yǎng)基（KNO3、KH2PO4用量加倍,其他成分保持不變）為基本培養(yǎng)基,通過添加不同種類與質量濃度的外源激素調制不同的增殖培養(yǎng)基.所有培養(yǎng)基中均加入蔗糖30 g/L,瓊脂粉4.6 g/L,pH調整為5.8,常規(guī)滅菌.

1.2.2 接種與培養(yǎng)在超凈工作臺上,選擇長勢及大小一致的太行菊不定芽塊,將其切成1 cm3大小,分別接種于以上各培養(yǎng)基,每種培養(yǎng)基接種20瓶,每瓶接種3塊.接種時不定芽塊基部嵌入培養(yǎng)基,不定芽生長點要外露.置于（25±1）℃,光周期12 h/d,1 500~2 000 lx照度下培養(yǎng).

1.2.3 調查項目與方法接種后7 d,定期觀察、記錄不定芽的增殖狀況及其長勢.培養(yǎng)40 d時,記錄每個處理的接種不定芽塊總數(shù)、芽塊大小、不定芽長勢（不定芽的葉色、葉片長度、葉片枯死情況等）、成苗數(shù)（有明顯伸長的莖,株高大于20 mm的小苗）等結果.然后,將增殖后的不定芽塊切割成與接種時的不定芽塊一樣大?。? cm3）,統(tǒng)計各處理增殖后芽塊的分割總塊數(shù),并計算各處理的增殖系數(shù)：不定芽增殖系數(shù)=增殖后芽塊的分割總塊數(shù)/接種芽塊總數(shù).

2 結果與分析

2.1 6-BA+NAA對太行菊不定芽增殖與生長的影響

在不同6-BA與NAA質量濃度配比的各培養(yǎng)基上,太行菊不定芽增殖與生長狀況見表1.

表1 不同6-BA/NAA配比對太行菊不定芽增殖與生長的影響Tab.1 Effect of different 6-BA/NAA concentration proportion on proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis adventitious buds

由表1可知,與添加激素的處理相比,在不添加任何激素的培養(yǎng)基（Ⅰ-1）上,太行菊不定芽的增殖與生長狀況表現(xiàn)最差：很少有新芽分化,芽塊小,增殖系數(shù)最低；芽塊中出現(xiàn)大量枯死的不定芽和葉片,呈黃褐色至黑褐色,甚至整個芽塊變褐枯死.因此,在太行菊不定芽的增殖培養(yǎng)中,培養(yǎng)基中添加一定劑量的植物激素是必需的.在添加激素的各培養(yǎng)基上,在一定質量濃度范圍內,隨著培養(yǎng)基中6-BA質量濃度的升高,芽塊變大,不定芽分化數(shù)量增多,增殖系數(shù)升高,芽塊中黃褐至褐色枯葉減少.在0.2 mg/L 6-BA配以0.05 mg/L NAA的培養(yǎng)基（Ⅰ-4）上,接種芽塊分化產生大量不定芽,芽塊大小與不定芽增殖系數(shù)均達到最大值.此外,該培養(yǎng)基上的不定芽生長正常,葉色鮮綠,長勢旺盛,除較大葉片的葉緣與葉尖呈現(xiàn)黃色外,芽塊中很少存在黃褐色至褐色的枯葉.當6-BA質量濃度達0.4 mg/L時（Ⅰ-5）,不定芽的增殖與生長狀況總體與Ⅰ-4處理相近,所不同的是,在Ⅰ-5培養(yǎng)基上,不定芽增殖系數(shù)有所下降,芽塊變小,芽塊中黃褐色枯葉增多.

此外,在較低的6-BA質量濃度（＜0.1 mg/L）下,隨著激素質量濃度的升高,不定芽生長趨于茁壯,每瓶中株高大于20 mm的小苗數(shù)也逐漸增加.當6-BA質量濃度為0.1 mg/L時,不僅形成的不定芽較大,每瓶可分離的小苗數(shù)也達到最多.但當6-BA質量濃度≥0.2 mg/L時,不定芽變小,每瓶中形成的小苗數(shù)也迅速減少.

由此可知,培養(yǎng)基中添加一定量的激素有利于太行菊不定芽的增殖與生長.當培養(yǎng)基中無激素時,不定芽分化數(shù)量少,且枯死嚴重；在0.05 mg/L NAA濃度下,0.2 mg/L的6-BA（Ⅰ-4）較適合太行菊不定芽的分化與增殖,而0.1 mg/L的6-BA（Ⅰ-3）較適合太行菊不定芽的生長和小苗的形成.

2.2 KT+NAA對太行菊不定芽增殖與生長的影響

KT與6-BA都是常用的細胞分裂素,對不定芽的分化與增殖都具有促進作用,但兩者的作用效果常因植物類型的不同而存在差異.在不同KT與NAA質量濃度配比的各培養(yǎng)基上,太行菊不定芽增殖與生長狀況見表2.

表2 不同KT/NAA配比對太行菊不定芽增殖與生長的影響Tab.2 EffectofdifferentKT/NAAconcentrationproportiononproliferationandgrowthofOpisthopappus taihangensis adventitiousbuds

由表2可知,隨著KT質量濃度的提高,分化形成的不定芽增多,不定芽增殖系數(shù)呈上升趨勢,而芽塊中枯死葉片減少.但總體而言,在不同質量濃度的KT+NAA配比下,各處理的不定芽增殖系數(shù)、芽塊大小、葉片大小等狀況都差異不大.因此,與不同質量濃度的6-BA+NAA處理相比,不同質量濃度的KT+NAA處理對太行菊不定芽增殖與生長的影響相對較小.

當KT與6-BA質量濃度相同并配以對應質量濃度的NAA時,6-BA較KT更有利于太行菊不定芽的增殖.表現(xiàn)為：在使用6-BA的培養(yǎng)基上,分化產生的不定芽更多,芽塊更大,不定芽增殖系數(shù)明顯提高,芽塊中枯死葉片數(shù)量有所減少.而在相同質量濃度的KT條件下,芽塊相對蓬松,不定芽數(shù)量少,芽塊中夾雜的黃褐色枯葉較多.值得注意的是,在含不同質量濃度KT的各培養(yǎng)基上,均有一定數(shù)量小苗的形成,且小苗生長茁壯,有些小苗株高可達40~50 mm.

2.3 6-BA+IBA對太行菊不定芽增殖與生長的影響

IBA也是常用的生長素,其作用活性較NAA要弱,但在有些植物的離體培養(yǎng)中,IBA較NAA更有利于不定芽的茁壯成長與根的分化[21].為了弄清IBA是否更適合太行菊不定芽的增殖與生長,進行了不同質量濃度IBA+6-BA組合試驗,結果見表3.

表3 不同6-BA/IBA配比對太行菊不定芽增殖與生長的影響Tab.3 Effect of different 6-BA/IBA concentration proportion on proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis adventitious buds

由表3可知,在相同6-BA質量濃度的條件下,不同質量濃度的IBA處理,不定芽的增殖與生長狀況相差不大,芽塊大小、不定芽增殖系數(shù)、芽塊中枯葉多少等參數(shù)在不同處理間都相近.同使用NAA的處理Ⅰ-3相比,在各6-BA/IBA配比的培養(yǎng)基上,芽塊中有較多的不定芽葉片呈現(xiàn)黃褐色,不定芽枯死較重.另外,在含IBA的各培養(yǎng)基上,形成的小苗數(shù)量也較Ⅰ-3處理要少,并且這些小苗植株低矮,生長纖弱,長勢較差.

因此,在太行菊不定芽的離體培養(yǎng)中,同NAA相比,在使用IBA的各培養(yǎng)基上,太行菊不定芽的生長狀況較差,不定芽枯死較重,芽塊上可分離的株高大于20 mm的小苗數(shù)量也很少.并且在含IBA的各培養(yǎng)基上,不定芽的分化與增殖也不具有明顯的優(yōu)勢.因此,在太行菊的離體培養(yǎng)中,不宜選擇IBA與6-AB配合使用用于不定芽的增殖與生長.

3 結論與討論

在植物的離體培養(yǎng)中,培養(yǎng)基中激素（尤其是細胞分裂素和生長素）的種類與配比是調控不定芽分化與生長的關鍵.若植物激素種類不當或濃度較低,常會導致不定芽分化數(shù)量少、增殖率低,甚至引起不定芽黃化、死亡；但激素濃度過高,也會導致分化的不定芽密集、纖弱,易出現(xiàn)畸形、玻璃化等問題[21-22].在已發(fā)表的太行菊的組織培養(yǎng)研究中,姚連芳等[17]發(fā)現(xiàn),在高質量濃度6-BA（2.0 mg/L）的MS培養(yǎng)基上,初代培養(yǎng)的太行菊頂芽或莖段常形成愈傷組織,有些外植體雖有不定芽的分化,但形成的不定芽細小,與米粒狀愈傷組織的大小相當.而在王建博等[18]的研究中,在6-BA質量濃度為1.0~2.0 mg/L的叢生芽誘導培養(yǎng)基上,繼代培養(yǎng)的組培苗呈現(xiàn)半透明狀的玻璃化.這些研究雖沒有涉及太行菊不定芽的增殖培養(yǎng),但他們的初代與繼代培養(yǎng)結果預示著,在太行菊的離體培養(yǎng)中不宜采用較高濃度的植物激素.我們在前期的預備性試驗中也發(fā)現(xiàn),較高的激素濃度,特別是較高的細胞分裂素質量濃度（6-BA,0.5~2.0 mg/L）雖能促進太行菊不定芽的大量分化,但形成的不定芽細小,葉片黃枯較重,且激素濃度越高,這種狀況越重.在自然生長環(huán)境中,太行菊的側芽萌發(fā)能力本身很強,單株形成眾多分枝,分枝上可再生分枝,形成簇生的單株.從其自然生長特性來看,在太行菊的離體培養(yǎng)中,植物激素的使用濃度也應不宜過高.本文試驗結果也進一步驗證了這一點：當配以低質量濃度NAA的情況下,0.2 mg/L的6-BA即已滿足太行菊不定芽增殖與生長的需要,不定芽分化數(shù)量與長勢均表現(xiàn)最優(yōu)；當6-BA質量濃度達0.4 mg/L時,芽塊變小,不定芽增殖系數(shù)下降,芽塊中黃褐色枯葉增多.

不過,在離體培養(yǎng)的特殊環(huán)境下,培養(yǎng)基中添加一定濃度的激素對太行菊不定芽的增殖與生長仍是必需的,否則將致使不定芽分化稀少,芽塊變褐枯死十分嚴重.在質量濃度為0.1 mg/L的6-BA作用下,雖然不定芽的分化增殖達不到理想狀態(tài),但形成的不定芽較大,每瓶中可分離的小苗數(shù)達到最多（3.27株/瓶）,遠遠高于6-BA質量濃度為0.2 mg/L的處理（0.55株/瓶）.若在維持一定不定芽增殖率的同時,想要獲得較多的小苗用于生根移栽,培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L 6-BA是較為理想的選擇.

雖然KT與6-BA、NAA與IBA分別是常用的細胞分裂素類和生長素類,但不同的植物種類在離體培養(yǎng)中,偏好的激素種類有所不同.本文試驗結果表明,與對應質量濃度的KT相比,使用6-BA的處理不定芽增殖率更高,而不定芽葉片枯死狀況更輕.雖然在含不同質量濃度KT的培養(yǎng)基上均有一定小苗的形成,但數(shù)量不多,均低于含0.1 mg/L 6-BA的處理.在細胞分裂素6-BA質量濃度一定的條件下,與使用NAA的處理相比,使用IBA的各處理最突出的劣勢是：芽塊中不定芽生長纖弱,葉片黃化與枯死嚴重.因此,在太行菊的離體培養(yǎng)中,不宜選擇KT、IBA用于不定芽的增殖與生長培養(yǎng).

綜上所述,在太行菊不定芽的離體培養(yǎng)中,培養(yǎng)基中添加一定量的植物激素是必需的,當培養(yǎng)基中無激素時,不定芽分化數(shù)量少,且不定芽枯死嚴重；細胞分裂素6-BA較KT,生長素NAA較IBA更適合太行菊不定芽的增殖與生長培養(yǎng)；當配以較低質量濃度NAA（0.05 mg/L）時,0.2 mg/L的6-BA較適合太行菊不定芽的分化與增殖,而0.1 mg/L的6-BA較適合太行菊不定芽的生長和小苗的形成.

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（責任編輯：鄧天福）

Effect of different hormone combinations on adventitious buds proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis in vitro

Zhao Yuanzeng,Yang Jing,Sun Haiyan
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

The effect of different combinations of plant hormones on adventitious buds proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis were studied on different media based on the modified MS medium（content of KNO3, KH2PO4doubled and other component unchanged）containing different types and concentration of hormone（6-BA, NAA,KT and IBA）.The results showed that：hormone 6-BA and NAA,in comparison with KT and IBA,were more suitable for proliferation and growth of O.taihangensis adventitious buds.The hormone combination of 6-BA and NAA with different concentration had a significant impact on adventitious buds proliferation and growth of O. taihangensis.Under the same concentration of 0.05 mg/L NAA,the cytokinin 6-BA at a concentration of 0.2 mg/L was more suitable for proliferation and differentiation of adventitious buds,whereas 0.1 mg/L 6-BA was recommendable for growth and development of adventitious buds of O.taihangensis.

Opisthopappus taihangensis；adventitious buds；culture in vitro；propagation coefficient；plant hormone

S682.1+1

A

1008-7516（2015）03-0016-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2015.03.004

2015-04-15

河南省教育廳科學技術研究重點項目（14B210005）；河南科技學院博士科研啟動基金（201010612002）

趙元增（1974―）,男,山東蒙陰人,博士,副教授.主要從事植物細胞工程與遺傳育種研究.