郭曉蕓，鄭亞男，杜霞，羅鳴，于文肖

(河北師范大學(xué) 匯華學(xué)院，河北 石家莊 050091)

功能化多壁碳納米管修飾的葡萄糖傳感器的研究

郭曉蕓，鄭亞男，杜霞，羅鳴，于文肖

(河北師范大學(xué) 匯華學(xué)院，河北 石家莊 050091)

在室溫下利用化學(xué)摻雜法合成了K摻雜多壁碳納米管KMWNTs,通過固定葡萄糖氧化酶(GOx)在KMWNTs修飾的玻碳電極表面，并利用葡萄糖氧化酶(GOx)的直接電化學(xué)，構(gòu)建了一種新型葡萄糖傳感器。利用掃描電鏡對MWNTs和KMWNTs的形貌進(jìn)行表征發(fā)現(xiàn)，K摻雜后沒有破壞MWNTs的管狀結(jié)構(gòu);采用電化學(xué)系統(tǒng)對傳感器的性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，與單一的MWNTs相比，KMWNTs顯示了更為有效的電催化活性。在此基礎(chǔ)上,以KMWNTs膜為基底構(gòu)建了抗干擾能力強、穩(wěn)定性好、靈敏度高、響應(yīng)快的葡萄糖傳感器，在-0.52 V的檢測電位下，該傳感器對葡萄糖響應(yīng)的線性范圍為0.1～3.0 mmol·L-1(R=0.998)，檢測限為0.02 mmol·L-1(S/N=3)，常見干擾物質(zhì)如抗壞血酸和尿酸的存在不影響測定。

多壁碳納米管；鉀；葡萄糖氧化酶；電化學(xué)

酶傳感器是生物傳感器的重要組成部分。自從1962 年Clark[1]制成第一只酶傳感器以來，酶傳感器便迅速發(fā)展成為新的分析裝置。它兼?zhèn)涿阜ê碗娀瘜W(xué)方法的優(yōu)點，測定迅速而準(zhǔn)確。特別是葡萄糖氧化酶傳感器，由于它可為糖尿病患者的臨床診斷提供非常重要的信息，因此它的研究已引起人們的高度重視[2]。但是這種方法的催化活性和穩(wěn)定性不高，并且受溫度、濕度以及pH值的變化影響較大。因此，尋找新材料、新方法制備電流響應(yīng)值高的新型葡萄糖傳感器非常必要。

碳納米管(CNTs)構(gòu)成了新的碳體系，其中化學(xué)摻雜在很大程度上修飾了它的物理性質(zhì)，并加強了它的催化活性[3-5]。最近，各種元素如鉀[4]、銫[6]、硼[7]、氮[8]、磷[9]和氯[10]等應(yīng)用于CNTs表面摻雜以調(diào)整它們的場效應(yīng)、電子、機械和導(dǎo)電性能，拓寬了CNTs的應(yīng)用領(lǐng)域。Chun等[11]室溫下制備了摻雜K的多壁碳納米管，并證實了它們在乙醇中的分散性能。盡管科學(xué)家們已進(jìn)行了各種各樣的研究，但是仍然沒有文獻(xiàn)報道關(guān)于摻雜的CNTs在葡萄糖傳感器方面的應(yīng)用。

本文在室溫下利用化學(xué)摻雜法合成的KMWNTs，展現(xiàn)了良好的膜穩(wěn)定性、優(yōu)越的生物兼容性和高的導(dǎo)電性。然后，以固定葡萄糖氧化酶(GOx)作模型酶，固定于KMWNTs修飾的玻碳電極(GCE)上，進(jìn)一步研究了GOx的直接電化學(xué)，探索KMWNTs在葡萄糖傳感器方面的應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

多壁碳納米管(>95%，直徑為20～30 nm)，深圳納米科技有限公司生產(chǎn)；葡萄糖氧化酶(GOx)，美國Amresco公司生產(chǎn)；鉀(K)、菲(98%)、二甲氧基乙院(99.5%,1,2-DME)、β-D-葡萄糖、抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)均由美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)；其它試劑均為分析純。

掃描電鏡圖(SEM)來自于JEOL JSM-6700F場發(fā)射掃描電鏡儀；循環(huán)伏安曲線(CV)在電化學(xué)工作站660C(上海辰華儀器設(shè)備公司，中國)上完成；電化學(xué)交流阻抗(EIS)測試在Autolab電化學(xué)分析儀(Eco Chemie，荷蘭)上完成，其電解質(zhì)溶液為含有5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol·L-1KCl溶液，交流電壓為5 mV，記錄頻率為10-2～105Hz；本實驗中所有的電化學(xué)測試均在0.1 mol·L-1的PBS中進(jìn)行，室溫為25±2 ℃，使用三電極系統(tǒng)，其中玻碳電極(GCE)為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。

1.2 KMWNTs的合成

室溫下利用化學(xué)摻雜方法合成KMWNTs，制備步驟如下[12]： MWNTs由體積比為3∶1的濃硫酸和濃硝酸處理4 h，離心，清洗至中性，60 ℃真空干燥；其后，在20 mL的1,2-DME(99.5%)溶液中，通過K(40 mg)和菲(0.2 mol·L-1)反應(yīng)制備菲/K絡(luò)合物溶液；然后，在上述絡(luò)合物溶液中加入20 mg MWNTs，磁力攪拌(500 r·min-1)，室溫下反應(yīng)48 h，所得產(chǎn)物用乙醇清洗，沉淀物于60 ℃干燥得KMWNTs，再將其置于乙醇中超聲分散得到0.5 mg·mL-1的KMWNTs懸浮液。

1.3 GOx/KMWNTs/GCE的制備

玻碳電極GCEs (d=3 mm, ca. 0.07 cm2)在SiC砂紙上打磨，在粒徑為1.0 μm和0.3 μm的A12O3上拋光至鏡面，分別在水和乙醇中超聲2 min，室溫下干燥。GOx/KMWNTs/GCE制備如下：先將5 μL 0.5 mg·mL-1的KMWNTs懸浮液滴涂于打磨好的電極上，室溫下干燥，即得到KMWNTs修飾的GCE，記作KMWNTs/GCE;然后，將KMWNTs/GCE浸入含有10 U·mL-1GOx的 0.1 mol·L-1PBS (pH 7.4 )中，置于4 ℃冰箱10 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 MWNTs和KMWNTs形貌的表征

MWNTs和KMWNTs微觀形態(tài)如圖1所示。圖1a中大量纏繞的MWNTs交錯在一起，形成三維均一的結(jié)構(gòu)。K摻雜后(圖1b)，與MWNTs相比，KMWNTs的管束沒有發(fā)現(xiàn)明顯的破損和斷裂，管束的直徑有少許變大，整體結(jié)構(gòu)變得松散;比表面積增大，吸附酶的能力增強。KMWNTs這種松散結(jié)構(gòu)在電催化活性和蛋白質(zhì)固定等方面起到了重要的作用。

圖1 MWNTs(a)和KMWNTs(b)的SEM照片F(xiàn)ig.1 The SEM images of MWNTs(a)和KMWNTs(b)

2.2 交流阻抗圖譜

電化學(xué)中常采用EIS阻抗譜的變化來表征電極表面的修飾過程，EIS的半圓直徑代表電極表面電子轉(zhuǎn)移阻抗(Ret) 的相對大小。圖2顯示了裸GCE， MWNTs/GCE和KMWNTs/GCE的交流阻抗波譜圖。以[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-作為電化學(xué)活性探針，裸GCE和MWNTs/GCE的奈奎斯特圖分別顯示了約850 ohm和600 ohm的電子傳遞阻抗，比KMWNTs/GCE的電子傳遞阻抗(300 ohm)要大許多，表明KMWNTs能在氧化還原探針和電極之間形成一個優(yōu)良的電子傳遞界面。

2.3 GOx/KMWNTs/GCE電極的直接電化學(xué)

基于在KMWNTs修飾電極上GOx的固定，我們在0.1 mol·L-1氮氣飽和的 PBS (pH7.4)中研究了GOx的直接電化學(xué)(圖3)。圖3A中在沒有GOx的存在下，各電極的循環(huán)伏安圖上均無特征峰出現(xiàn)；圖3B中GOx/KMWNTs/GCE出現(xiàn)了一對明顯且峰形對稱的氧化還原峰,其峰電流大于GOx、MWNTs/GCE,而GOx/GCE無任何氧化還原峰，其電位分別在-0.501 V和-0.478 V，顯示了在無電子轉(zhuǎn)移媒介體的情況下酶分子的氧化還原活性中心和電極之間良好的電子傳遞過程。

圖2 裸GCE(a) ，MWCNT/GCE(b) ，KMWCNT/GCE(c)在5.0 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol·L-1 KCl底液中的交流阻抗圖Fig.2 Electrochemical impedance spectra of bare(a),MWNTs(b) and KMWNTs(c) modified GCEs in 0.1 mol·L-1 KCl solution containing 5 mmol·L-1 K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]

與圖3A的循環(huán)伏安圖(無GOx)相比較，我們可以斷定該氧化還原峰應(yīng)歸屬于GOx。結(jié)果表明：KMWNTs比MWNTs更有利于GOx的直接電化學(xué)。

2.4 GOx/KMWNTs/GCE的線性關(guān)系和檢出限

圖4A顯示了GOx/KMWNTs/GCE在氮氣飽和的PBS中響應(yīng)電流隨葡萄糖濃度變化的差分脈沖伏安曲線。如圖4A可知，在0.1 mol·L-1氮氣飽和的PBS(pH7.4)中，葡萄糖的濃度從0，0.1，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.2，2.6，3.0 mmol·L-1依次變化時，隨著葡萄糖濃度的增加，還原峰電流逐漸降低。而且，還原峰電流的降低量與葡萄糖濃度之間存在良好的線性關(guān)系(圖4B)，相關(guān)系數(shù)R=0.998，傳感器的線性范圍為0.1～3.0 mmol·L-1，檢出限(S/N=3)為0.02 mmol·L-1，該傳感器對葡萄糖的檢測靈敏度較高[13]。

2.5 GOx/KMWNTs/GCE抗干擾能力測試

為了評價傳感器的抗干擾能力，向含有0.5 mmol·L-1的葡萄糖溶液中分別加入濃度為0.05 mmol·L-1尿酸(UA)以及抗壞血酸(AA)進(jìn)行實驗，如圖5所示，結(jié)果表明加入的AA與UA對葡萄糖的測定無明顯的干擾。對這2種干擾物質(zhì)具有良好的抗干擾能力，說明該傳感器具有較好的選擇性。為了評價傳感器的重現(xiàn)性，分別制備5根GOx/KMWNTs/GCE測定5 mmol·L-1葡萄糖溶液，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別是4.1%，4.4%，4.7%和5.1%。此外，用同一根GOx/KMWNTs/GCE 5次測定5 mmol ·L-1葡萄糖溶液，其RSD是1.9%。當(dāng)傳感器不用時，4 ℃保存，定期測試，結(jié)果如圖6所示，第8天其響應(yīng)電流約為最初響應(yīng)的97%；一個月以后，其響應(yīng)電流約為最初響應(yīng)的77%。表明該傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

圖3 在0.1 mol·L-1 氮氣飽和的PBS(pH7.4)溶液中(A)裸GCE(a), MWNTs/GCE(b), KMWNTs/GCE (c)；(B)GOx /GCE(a),GOx/MWNTs/GCE (b),GOx/KMWNTs/GCE (c)的循環(huán)伏安曲線 掃速：30 mV s-1Fig.3 Cyclic voltammograms of different electrodes in 0.1 molL-1 nitrogen-saturated PBS (pH 7.4). (A) Bare GCE (a),MWNTs/GCE (b),KMWNTs/GCE (c); (B)GOx /GCE(a),GOx/MWNTs/GCE (b),GOx/KMWNTs/GCE (c); Scan rate: 30 mV s-1

圖4 (A)GOx/KMWNTs/GCE在氮氣飽和的0.1 mol·L-1PBS(pH7.4)中響應(yīng)電流隨葡萄糖濃度變化的差分脈沖伏安曲線；(B)峰電流與葡萄糖濃度關(guān)系曲線Fig.4 (A)Differential pulse voltmmograms of the GOx/KMWNTs/GCE in nitroger-saturated 0.1 mol·L-1 pH 7.4 PBS with different glucose concentrations:0.0,0.1,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.2,2.6,3.0 mmol·L-1;(B)Calibration curves of the GOx/KMWNTs/GCE for glucose

圖5 抗干擾物質(zhì)存在下GOx/KMWNTs/GCE的相應(yīng)電流Fig.5 Amperometric responses of the GOx/KMWNTs/GCE in the absence and presence of interferent

圖6 時間對GOx/KMWNTs/GCE穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of duration on the response of the biosensor to 5 mmol·L-1 glucose in 0.1 mol L-1 PBS (pH 7.4)

3 小結(jié)

通過固定GOx在KMWNTs修飾的玻碳電極表面，并利用GOx的直接電化學(xué)，構(gòu)建了一種新型的葡萄糖傳感器。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)K摻雜后不僅沒有破壞MWNTs的管狀結(jié)構(gòu)，而且還有良好的膜穩(wěn)定性、優(yōu)越的生物兼容性和高的導(dǎo)電性，可以用來增強電化學(xué)響應(yīng)，并提供顯著增加的有效面積以利于蛋白質(zhì)的負(fù)載，加速了酶活性區(qū)和電極表面之間的電子傳遞。采用電化學(xué)系統(tǒng)對傳感器的性質(zhì)進(jìn)行了研究，GOx/KMWNTs/GCE展示了良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，以及高的靈敏性和無干擾性，因此，KMWNTs能作為一種優(yōu)異的材料用于氧化還原活性酶的直接電化學(xué)，并構(gòu)建相關(guān)的酶生物傳感器。

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(責(zé)任編輯：孫新華)

Glucose Sensor Based on Potassium-doped Multi-walled Carbon Nanotubes

GUO Xiaoyun, ZHENG Yanan, DU Xia, LUO Ming，YU Wenxiao

(Huihua College of Hebei Normal University, Shijiazhuang Hebei 050091, China)

The potassium-doped multi-walled carbon nanotubes (KMWNTs) were synthesized according to the chemical K doping at room temperature. We demonstrate herein a newly developed amperometric glucose biosensor by using the direct electron transfer of glucose oxidase (GOx), which is base on the immobilization of GOx on KMWNTs modified electrodes. The structures of the MWNTs and KMWNTs were characterized by scanning electron microscopy( SEM). After K-doping, no disruption of MWNTs morphology is observed . As a new platform in glucose analysis, the resulting electrode (GOx/KMWNTs/GCE) exhibits a sensitive response to glucose, with a linear range from 0.1 to 3.0 mmol·L-1(R=0.998) and a detection limit of 0.02 mmol·L-1(S/N=3). At an applied potential of -0.52 V, the resulting biosensor performs a sensitive and selective electrochemical response to glucose in the presence of common interferences, such as ascorbic acid (AA) and uric acid (UA). These results indicated that the GOx/KMWNTs modified glassy carbon electrode presents stable, high sensitivity and also exhibits fast amperometric response to the detection of glucose, which is promising for the development of glucose sensor.

multi-walled carbon nanotubes; potassium; glucose oxidase; electrochemistry

10.16018/j.cnki.cn32-1650/n.201504012

2015-08-31

郭曉蕓(1981-)，女，河北石家莊人，講師，碩士，主要研究方向為生物傳感器。

O657.1

A

1671-5322(2015)04-0051-05