江 念，陳根洪，鄭小江，2?，陳耀兵

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北民族學(xué)院），湖北 恩施 445000；3.湖北民族學(xué)院園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

正交法優(yōu)化烏蘞莓多糖提取工藝研究

江 念1，陳根洪1，鄭小江1，2?，陳耀兵3

（1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北民族學(xué)院），湖北 恩施 445000；3.湖北民族學(xué)院園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

為深度開發(fā)利用烏蘞莓，以烏蘞莓復(fù)葉為材料，采用水浸提法考察提取溫度、提取時(shí)間、料液比三個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響.用硫酸苯酚法測(cè)定多糖的含量并以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理和分析.結(jié)果表明：提取時(shí)間和料液比的影響達(dá)到極顯著水平，提取溫度的影響達(dá)到顯著水平.烏蘞莓多糖得率最高提取工藝為：提取時(shí)間1h、提取溫度90℃、料液比1∶80，多糖得率為5.16%.

烏蘞莓；多糖提?。徽粌?yōu)化

烏蘞莓（Cayratia japonica（Thunb）Gagne.為葡萄科烏蘞莓屬（Cayratia）植物．別名母豬藤、五爪龍、五葉藤、地五加等［1－2］.具有清熱解毒、解毒消腫、活血散淤、利尿止血的作用［3－4］.且易采集和炮制，全草皆可入藥，對(duì)痢疾桿菌、溶血性葡萄球菌、大腸桿菌有很好的抑制作用［5－6］.烏蘞莓屬植物在亞洲、歐洲、和非洲約有30余種，在我國約有16種，主產(chǎn)秦嶺以南各省區(qū)［1］.烏蘞莓在恩施州分布廣泛、易于栽種，發(fā)展前景良好.

隨著現(xiàn)代研究的深入，多糖的藥用價(jià)值和保健功能逐漸被認(rèn)可.研究證明，多糖具有抗病毒、抗癌、降血糖血脂、抗氧化抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等多種保健功能，多糖的市場(chǎng)需求也在不斷擴(kuò)大［7－10］.近年來，對(duì)烏蘞莓藥理及化學(xué)成分方面的研究較多，但對(duì)烏蘞莓活性成分提取工藝的研究還鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)通過優(yōu)化烏蘞莓多糖提取工藝，為深度開發(fā)利用恩施州烏蘞莓野生資源提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

材料：烏蘞莓采自于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所中藥材實(shí)驗(yàn)基地（恩施市新塘鄉(xiāng)長嶺崗）.主要試劑：蘆丁、葡萄糖、石油醚、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉.

1.2 儀器與設(shè)備

TU－1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DFY—500高速粉碎機(jī)（由天津泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)）；GXZ－9140數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SZ－93雙重蒸餾水器（上海亞榮生化儀器廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；FA－1004B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TDL－80－2B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料處理 取烏蘞莓復(fù)葉，置于烘箱中60℃烘干，用粉碎機(jī)粉碎成粉末，過60目篩，保存?zhèn)溆?

1.3.2 烏蘞莓多糖提取以及其含量測(cè)定 提取方法：水提醇沉法［11－12］，測(cè)定方法：硫酸苯酚法［13］.

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖樣品200.00mg，加蒸餾水溶解，定容至200mL，制成1.00mg·mL－1溶液，取出100 mL上述溶液液于1000 mL容量瓶中，制成0.1mg·mL－1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別精確量取上述溶液10、20、30、40、50、60 mL，置于6個(gè)100mL容量瓶中，加蒸餾水搖勻定容.分別取1mL，置于6個(gè)25mL的具塞試管中，加入新制成的5%的苯酚溶液1.0mL，再快速加入5mL濃硫酸，另以1mL蒸餾水為對(duì)照.在25℃溫度下放置30min，波長490nm處測(cè)定其吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.得回歸方程為：y＝10．417x－0．0055，R2＝0．9997．

式中：C為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)mg／（mL）－1；V為最終稀釋體積／mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量／mg.

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1）稱取0.4g烏蘞莓粉末放入具塞試管中，固定提取時(shí)間2h、提取溫度70℃，設(shè)定料液比1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100，探究料液比對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響.

2）稱取0.4g烏蘞苺粉末放入具塞試管中，固定提取時(shí)間2 h、料液比1：80，設(shè)定溫度60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，探究提取溫度對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響.

3）稱取0.4g烏蘞苺粉末放入具塞試管中，固定料液比1∶80，提取溫度80℃，設(shè)定時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5 h，研究提取時(shí)間對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響.

1.3.5 正交實(shí)驗(yàn) 由單因素結(jié)果，確定正交試驗(yàn)因素水平表，見表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 The factors and lever of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響

料液比對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響，見圖1.由圖1可得，隨著料液比的增加，烏蘞莓多糖得率逐漸增加，但是在1∶60、1∶80、1∶100處已趨平緩，考慮資源問題1∶60為比較理想的料液比.

2.2 提取溫度對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響

提取溫度對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響，見圖2.由圖2可得，隨著溫度的增加，烏蘞莓多糖得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，并在80℃處有最大值，80℃后多糖得率下降可能是由于高溫導(dǎo)致多糖內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，故選擇最適提取溫度為80℃.

圖1 料液比對(duì)烏蘞莓多糖得率影響Fig.1 Effect of solid／liquid ratioon the yields of polysaccharides in Cayratia japonica

2.3 提取時(shí)間對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響，見圖3.由圖3可得，隨著時(shí)間的推移，烏蘞莓多糖得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，并在1h處有最大值，1h后多糖得率下降可能是持續(xù)高溫破壞了多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，故選擇最適提取時(shí)間為1h.

圖2 提取溫度對(duì)烏蘞莓多糖得率影響 Fig.2 Effect of extraction temperatureon the yields of polysaccharide in Cayratia japonica

圖3 提取時(shí)間對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction timeon the yields of polysaccharides in Cayratia japonica

2.4 烏蘞莓多糖得率正交試驗(yàn)

以提取溫度、提取時(shí)間、料液比設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)為3個(gè)重復(fù)，取兩個(gè)接近值制得表2.

表2 烏蘞莓多糖得率正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The result of orthogonal experimentof polysaccharide in Cayratia japonica

正交試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3和表4.

表3 烏蘞苺正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.3 The analysis of variance of orthogonal experiment in Cayratia japonica

表4 提取時(shí)間、提取溫度、料液比對(duì)烏蘞莓多糖得率影響的Duncan多重比較結(jié)果Tab.4 Duncan Multiple comparison results of extraction temperature，extraction time and ratio of material to liquor influenced on the yield of polysaccharides Cayratia japonica

由表3可知，F(xiàn)A＝879.016、FB＝4.096、FC＝29.034，A、C兩個(gè)因素的P值小于0.01，達(dá)到極顯著水平，因素B的P值小于0.05，達(dá)到顯著水平，這表明料液比和提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著的影響，提取溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響.由表4得，烏蘞莓多糖最佳提取工藝為A2B2C3，即提取時(shí)間1 h、提取溫度90℃、料液比1∶80.

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果，準(zhǔn)確稱取烏蘞莓粉末0.4g，以正交方差分析所得最佳優(yōu)化組合A2B2C3處理樣品后，所得烏蘞莓多糖得率為5.16%，和正交試驗(yàn)中的結(jié)果接近且高于其他組合，表明該優(yōu)化組合能有效的提高烏蘞莓多糖得率.

3 結(jié)論

本研究通過單因素和正交試驗(yàn)，探求提取時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)烏蘞莓多糖得率的影響，結(jié)果表明其最佳提取工藝為：提取時(shí)間1h、提取溫度90℃、料液比1∶80，多糖得率為5.16%.本試驗(yàn)為烏蘞莓的開發(fā)利用提供相應(yīng)的理論指導(dǎo).

［1］《中國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥藥匯編［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1983：214－215.

［2］中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒［M］.北京：科學(xué)出版社出版，第2冊(cè)，1976：782－783.

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責(zé)任編輯：高 山

Orthogonal Optimization of Extraction Procedure of Polysaccharide in Cayratia japonica

JIANG Nian1，CHEN Genhong1，ZHENG Xiaojiang1，2?，CHEN Yaobing3
（1.School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China；2.Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province（Hubei University for Nationalities），Enshi 445000，China；3.School of Gardening Forestry，Hubei Uniersity for Nationalities，Enshi 445000，China）

In order to develop and utilize Cayratia japonica deeply，we adopt water extraction to investig?aret the effect of extraction temperature，extraction time and ratio of material to liquor on the yield of poly?saccharides using Cayratia japonica′s compound leaves as materials.The phenol－sulfuric acid method is used to measure the content of polysaccharides，and the SPSS statistical software is used to process and analyze the orthogonal experiment results.The results indicated that the effects of extraction time and ratio of material to liquor reached an extremely significant level，while the effects of extraction temperature reached a significant level.The extraction process which was the highest yield of Cayratia japonica poly?saccharides was extraction time 1 h，extraction temperature 90℃ and ratio of material to liquor 1∶80 when the yield of polysaccharides was 5.16%.

Cayratia japonica；extraction of polysaccharide；orthogonal optimization

TS201.4

A

1008－8423（2015）03－0334－03

10.13501／j.cnki.42－1569／n.2015.09.027

2015－07－26.

湖北省自然科學(xué)基金創(chuàng)新群體項(xiàng)目（2009CD115）；湖北省教育廳高校產(chǎn)學(xué)研究項(xiàng)目（CYX2009B037）.

江念（1991－），男，碩士生，主要從事林特食品資源保護(hù)與利用的研究；?

鄭小江（1958－），男，教授，主要從事野生植物資源保護(hù)與利用的研究.