王東方，王慶忠

（濰坊學(xué)院山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊 261061）

高活性降解羽毛角蛋白菌株鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

王東方，王慶忠

（濰坊學(xué)院山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊 261061）

通過對已篩選到的產(chǎn)生角蛋白酶的H菌株形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)分析最終確定該菌為枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis），對該菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)將顯著影響條件進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10g，豆粕10g，MgCl20．1g，CaCl20．06g，NaCl 0．5g，K2HPO41．4g，KH2PO40．7 g，羽毛粉10g，水1 000mL，培養(yǎng)基pH 7．5～8．0；最適培養(yǎng)條件：接種量為2%，培養(yǎng)溫度37℃，180r／min搖床培養(yǎng)96h，其產(chǎn)角蛋白酶活性最高為2．56×10－3kat／L（153．7U／mL）。

角蛋白酶鑒定；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵條件

隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，蛋白質(zhì)飼料嚴(yán)重短缺。羽毛蛋白被認(rèn)為是一種有獨(dú)特價(jià)值的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料，禽類羽毛中角蛋白的粗蛋白含量高達(dá)85%～89%，并且含有多種必需氨基酸［1－2］，因此若將廢棄的羽毛加以適當(dāng)?shù)募庸ぬ幚硎蛊滢D(zhuǎn)化為良好的蛋白質(zhì)資源，對經(jīng)濟(jì)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)都具有重要意義［3－4］。

角蛋白（keratin）是一種不溶性蛋白質(zhì)，肽鏈之間形成許多二硫鍵，不能被動(dòng)物直接利用。目前，我國處理羽毛等角蛋白廢棄物的方法主要有化學(xué)處理法、高溫高壓水解法等，這些方法轉(zhuǎn)化率低、耗能高、環(huán)境污染嚴(yán)重［5－6］。利用產(chǎn)生角蛋白酶的微生物將羽毛廢棄物分解為可利用的氨基酸等物質(zhì)，具有消化率高、對環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn)。近幾年發(fā)表的降解羽毛的微生物有細(xì)菌［7－8］、放線菌［9－10］、真菌［11－12］等，但在羽毛角蛋白分解菌的培養(yǎng)和篩選的研究領(lǐng)域僅處在初級階段，還沒有能夠有效提高羽毛角蛋白的生物學(xué)利用率的菌株，也沒有加工工藝簡單且成本低的產(chǎn)品工藝。

本研究利用已得到的分解羽毛高產(chǎn)菌株H菌，進(jìn)行菌種鑒定并通過其培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，使得H菌的產(chǎn)酶能力有很大提升，進(jìn)而為使其應(yīng)用于飼料等領(lǐng)域提供條件。

1 材料與儀器

1．1 材料

樣品來源：菌種H菌株由微生物實(shí)驗(yàn)室篩選得到；羽毛采集于羽毛加工廠廢棄的完整羽毛。

羽毛培養(yǎng)基：NaCl 0．5g，MgCl20．1g，CaCl20．06g，K2HPO41．4g，KH2PO40．7g，羽毛粉10g，水1 000mL，培養(yǎng)基pH7．5～7．8。

種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母提取5g，氯化鈉10g，水1 000mL，培養(yǎng)基pH7．0～7．2。

1．2 試驗(yàn)儀器

智能生化培養(yǎng)箱（PHX－270N，寧波海曙來福儀器廠）；雙層恒溫?fù)u床（THZ－052D，上海博彩生物科技有限公司）；雙人雙面凈化工作臺(tái)（CSW－CJ－2F型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（LD2X－50FB，上海申安醫(yī)療器械廠）；臺(tái)式大容量高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5810R，eppendorf）；紫外可見分光光度計(jì)（UV－2480，日本島津公司）；顯微鏡（BX53日本Olympus公司）。

2 方法

2．1 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：在LB平板上37℃培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)、色澤、邊緣、表面凹凸度、透明度等；進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)和芽孢形狀。生理生化性質(zhì)的測定參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［13］。

2．2 角蛋白酶活性測定

角蛋白測定參考Gradisar等［14］的方法并稍做修改。在試管中加入10mg羽毛粉作為反應(yīng)底物，取1．0 mL粗酶液，再加入2．0mL、0．05mol／L的Tris·HCl（pH7．5），50℃反應(yīng)30min后取出并加入2．0mL、10%的TCA以終止反應(yīng)，過濾離心10min，取上清液于280 nm處測定吸光度。酶活性單位定義：在上述反應(yīng)條件下，測得的D280nm值每升高0．01所需要的酶量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。

2．3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響：分別在搖瓶發(fā)酵24、48、72、96、120h時(shí)測定酶活性。

（2）發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響：分別設(shè)置搖瓶發(fā)酵溫度為34、37、40、43、46℃，測定發(fā)酵酶活性。

（3）不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響：選擇葡萄糖、蔗糖、麩皮、可溶性淀粉和玉米粉作為碳源，在羽毛培養(yǎng)基中分別添加1%的上述幾種碳源后搖瓶發(fā)酵，測定發(fā)酵酶活性；確定最佳碳源后，再在羽毛培養(yǎng)基中分別添加0．5%，1．0%，1．5%，2．0%，2．5%的最佳碳源。

（4）輔助氮源對菌株產(chǎn)酶的影響：選擇NaNO3、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、豆粕作為輔助氮源，在羽毛培養(yǎng)基中分別添加1%的上述幾種氮源后搖瓶發(fā)酵，測定發(fā)酵酶活性，再進(jìn)行最佳氮源的單因子分析（參照③最佳碳源實(shí)驗(yàn)）。

（5）初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響：不同初始pH（6．0，7．0，7．5，8．0，8．5，9．0）的羽毛培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定發(fā)酵酶活性。

3 結(jié)果與分析

3．1 菌株鑒定

3．1．1 形態(tài)特征

菌株H經(jīng)平板劃線培養(yǎng)出的菌落形態(tài)特征如圖1所示：菌落形狀不規(guī)則、乳白色、質(zhì)地潤澤、邊緣缺刻狀、不透明，經(jīng)革蘭氏染色法鏡檢菌體呈桿狀，常以鏈狀排列，具圓端，為革蘭氏陽性，能產(chǎn)芽孢，芽孢形狀呈橢圓形。

圖1 H菌形態(tài)

3．1．2 生理生化特征

菌株的生理生化鑒定結(jié)果見表1。芽孢桿菌屬的菌體呈直桿狀，常成對或鏈狀排列，具圓端或方端，大多數(shù)細(xì)胞在幼齡培養(yǎng)時(shí)染色呈現(xiàn)革蘭氏陽性；菌體以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，芽孢具橢圓、卵圓、柱狀、圓形的多種形態(tài)，可以抗多種不良環(huán)境；每個(gè)菌體能產(chǎn)一個(gè)芽孢且不被氧氣所抑制，為好氧或兼性厭氧異養(yǎng)菌，具有多種發(fā)酵或呼吸代謝類型。通過形態(tài)特征及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，可以確定菌株H為枯草芽孢桿菌。

表1 菌株H的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

表1 （續(xù)）

3．2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

3．2．1 發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響

菌體生長需要一定的時(shí)間，當(dāng)菌生長到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)，微生物經(jīng)過一段時(shí)間的生長，由于營養(yǎng)物質(zhì)已不多，只能維持菌體基本新陳代謝和合成次級代謝產(chǎn)物的需要，一些重要的次級代謝產(chǎn)物是在穩(wěn)定期開始大量生成的。所以，發(fā)酵時(shí)間是影響菌株產(chǎn)酶的重要因素。分別在搖瓶發(fā)酵24、48、72、96、120h時(shí)，測定的酶活性結(jié)果見圖2。可以看出，在發(fā)酵96h后，菌株的產(chǎn)酶活性濃度最高為1．76×10－3kat／L（105．5U／mL）。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間下H菌的發(fā)酵酶活性濃度

3．2．2 發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

微生物的生長及代謝產(chǎn)物的合成都需要酶的參與，適宜的溫度可以促進(jìn)微生物的生長，不適宜的溫度使菌體生命活力降低，甚至?xí)斐晌⑸锏乃劳?。此外，在不同的培養(yǎng)溫度下，微生物的代謝產(chǎn)物也不盡相同，并且微生物生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度也不一樣。分別設(shè)定搖瓶發(fā)酵溫度為34、37、40、43、46℃，測得的發(fā)酵酶活性濃度見圖3。由圖3可知，H菌的最適發(fā)酵溫度為37℃，此時(shí)酶活性濃度為1．84×10－3kat／L（110．6U／mL）。

圖3 不同發(fā)酵溫度下H菌的發(fā)酵酶活性濃度

3．2．3 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

在微生物發(fā)酵過程中，碳源不僅是細(xì)胞分子的組成部分，也是合成多糖、蛋白的能量來源。不同細(xì)胞對碳源的利用差異很大，碳源的代謝速率影響到微生物的生長和初級及次級代謝產(chǎn)物的形成［15］。在碳源的選擇方面要注意到微生物營養(yǎng)的需求和是否存在對合成代謝的誘導(dǎo)及阻遏作用，故選擇合適的碳源將提高菌株的產(chǎn)酶能力。在羽毛培養(yǎng)基中分別添加1%葡萄糖、蔗糖、麩皮、可溶性淀粉和玉米粉作為輔助碳源后，分別測得的酶活見表2。結(jié)果表明輔助碳源中的最佳碳源為玉米粉。這可能是玉米粉除碳水化合物外，還富含蛋白質(zhì)，在提供了碳源的同時(shí)，還提供了氮源，進(jìn)而提高了菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的能力。另外，從工業(yè)生產(chǎn)降低成本的角度看，玉米粉也是比較理想的碳源。在培養(yǎng)基中分別添加0．5%，1．0%，1．5%，2．0%，2．5%的玉米粉后測定的酶活變化趨勢見圖4。由圖4得出，在培養(yǎng)基中添加1．0%的玉米粉時(shí)H菌的發(fā)酵酶活性最大，酶活性濃度為2．09×10－3kat／L（125．6 U／mL），低于或高于1%時(shí)酶活性濃度均有所下降。

表2 添加不同輔助碳源時(shí)H菌的發(fā)酵酶活性濃度

圖4 添加不同含量玉米粉后H菌的發(fā)酵酶活性濃度

3．2．4 輔助氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

氮源主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等和含氮代謝物的合成。H菌所產(chǎn)的角蛋白酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，故而外加氮源可以影響酶的合成。通常能被細(xì)菌利用的氮源有銨鹽、硝酸鹽及尿素等，但在吸收速度與利用程度上有所差別［16］。本試驗(yàn)利用在羽毛培養(yǎng)基中分別添加1%的NaNO3、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、蛋白胨、酵母膏、豆粕作為輔助氮源后，分別測得的酶活性濃度見表3。結(jié)果表明輔助氮源中的最佳氮源為豆粕。在培養(yǎng)基中分別添加0．5%，1．0%，1．5%，2．0%，2．5%的豆粕后測定的酶活變化趨勢見圖5。由圖5得出，在培養(yǎng)基中添加1%的豆粕時(shí) H 菌的發(fā)酵酶活性最大，酶活性濃度為2．138×10－3kat／L（128．3U／mL）。

表3 添加不同輔助氮源時(shí)H菌的發(fā)酵酶活

圖5 添加不同含量的豆粕后H菌的發(fā)酵酶活性濃度

3．2．5 培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基初始pH不僅會(huì)引起細(xì)胞膜電荷的變化，同時(shí)也會(huì)改變培養(yǎng)基中化合物的解離程度，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，即使是同一微生物，由于pH不同，所得到的產(chǎn)物也不相同［17］。將菌株置于不同初始pH（6．0，7．0，7．5，8．0，8．5，9．0）的羽毛培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵后，測得的酶活變化趨勢見圖6。由圖6可知，H菌在培養(yǎng)基初始pH為7．5時(shí)產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，酶活性濃度為1．81×10－3kat／L（108．4U／mL）。

3．2．6 正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件

圖6 不同初始pH下H菌的發(fā)酵酶活性濃度

根據(jù)上述單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)以確定菌株發(fā)酵的最佳條件，結(jié)果見表4，培養(yǎng)基中不同水平的玉米粉、豆粕對菌株產(chǎn)酶能力影響顯著。正交試驗(yàn)結(jié)果，表明在培養(yǎng)溫度為37℃、添加玉米粉為1%、豆粕1%、初始pH為7．5～8．0時(shí)發(fā)酵產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，酶活性濃度為2．56×10－3kat／L（153．7U／mL）。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

得到的一株可降解羽毛角蛋白的菌株H具有高效降解羽毛角蛋白活性。根據(jù)菌種H的表型及生理生化反應(yīng)方面的結(jié)果，可以確定該降解羽毛角蛋白菌株為枯草芽孢桿菌；通過對其發(fā)酵條件研究，綜合各單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，分析得到其最佳發(fā)酵條件：最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉10g、豆粕10g，MgCl20．1g，CaCl20．06g，NaCl 0．5g，K2HPO41．4g，KH2PO40．7g，羽毛粉10g，水1 000mL，培養(yǎng)基pH 7．5～8．0；最適培養(yǎng)條件：接種量為2%，培養(yǎng)溫度37℃，180r／min搖床培養(yǎng)96h，在該優(yōu)化條件下該菌的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，最高酶活性濃度為2．56×10－3kat／L（153．7U／mL），比初始酶活提高了45．7%。此外，得到的最佳碳源、氮源不僅能使其酶活得到大幅提高，而且來源廣泛、價(jià)格低，為角蛋白酶投入大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

在今后的研究中，可以進(jìn)行角蛋白的提取分離、純化等方面的研究，并且可以應(yīng)用基因工程等技術(shù)將產(chǎn)酶基因克隆并接合到生長較快速的菌體中，進(jìn)一步提高角蛋白酶的表達(dá)量和活性并拓寬其應(yīng)用范圍，以更好地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。

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Identification and optimization of fermentation conditionsfor astrain of highly active degradation of feather keratin

Wang Dongfang，Wang Qingzhong
（Key Laboratory of Biochemistry ＆Molecular Biology in Universities of Shandong Province，Weifang University，Weifang 261061，China）

The strain H is identified as bacillus subtilis，based on morphology，physiological and biochemical characteristics．And the fermentation conditions of the strain are optimized，while significantly affecting the conditions which are optimized by orthogonal test．The results show that the optimal fermentation medium will be corn powder 5g，soybean meal 10g，MgCl20．1g，CaCl20．06g，NaCl 0．5g，K2HPO41．4g，KH2PO40．7g，10g feather powder，water 1 000mL，pH 7．5－8．0，and the optimal culture conditions are as follows：inoculation the amount of 2%，temperature 37℃，180r／min shaking culture 96h，the production of keratinase activity up to 2．56×10－3kat／L 153．7（U／mL）．

identification of feather keratin；keratinasebacillus subtilis；fermentation conditions

S816．48

B

1002－4956（2015）3－0063－05

2014－08－31 修改日期：2014－09－24

山東省星火計(jì)劃項(xiàng)目（2012XH06031）；濰坊市科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011022、20111023）；濰坊學(xué)院科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012z07）

王東方（1970—），男，山東濰坊，碩士，講師，研究方向?yàn)槲⑸锷砩鞍l(fā)酵．

E－mail：wangdf＠wfu．edu．cn