劉勇，張鵬威，蘇文琴，劉曉，鞏克明，項(xiàng)妮

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，溫州 325027；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，?？?571199；3.浙江省溫州市中醫(yī)院，溫州 325000；4.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鹽城 224005)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

大孔吸附樹脂純化裸花紫珠總黃酮的工藝優(yōu)選*

劉勇1，張鵬威2，蘇文琴2，劉曉3，鞏克明4，項(xiàng)妮2

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，溫州 325027；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海口 571199；3.浙江省溫州市中醫(yī)院，溫州 325000；4.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鹽城 224005)

目的 優(yōu)選裸花紫珠總黃酮的大孔吸附樹脂純化工藝。方法 以總黃酮的吸附率和洗脫率為指標(biāo)，采用靜態(tài)吸附優(yōu)選AB-8 、D-101、HP-20、HP2MG等大孔吸附樹脂的型號(hào)；通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選裸花紫珠的動(dòng)態(tài)吸附分離參數(shù)。結(jié)果 HP-20型樹脂的吸附效率較高，其最佳的純化工藝為pH 3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液，以3 BV·h-1流速上樣，3 BV·h-1水洗1 h，再用75%乙醇4 BV，以2 BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，經(jīng)大孔吸附樹脂純化后的裸花紫珠總黃酮的平均純度可達(dá)47.4%。結(jié)論 HP-20型大孔吸附樹脂適用于裸花紫珠總黃酮的初步純化。

裸花紫珠；總黃酮；大孔吸附樹脂

裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.et Arn.)為馬鞭草科紫珠屬植物的干燥地上部分，主要分布于我國廣東、廣西、海南等地，具有抗菌、止血、散瘀消腫之功效，主治各種炎癥、外傷出血、跌打腫痛、風(fēng)濕腫痛、肺結(jié)核咳血、胃腸出血等癥[1 ]。文獻(xiàn)報(bào)道裸花紫珠有效成分主要為總黃酮，如紫珠萜酮、芹菜素、木犀草素、槲皮素、蘆丁及其配糖體等黃酮類物質(zhì)[2-3]。據(jù)悉目前上市的裸花紫珠制劑的提取工藝主要為水煎煮提取，定量質(zhì)量控制主要以蘆丁作為對(duì)照測(cè)定總黃酮[4]。然而目前裸花紫珠水提取物中總黃酮的含量較低，為了提高總黃酮含量，減小服用劑量，筆者采用大孔吸附樹脂法純化裸花紫珠總黃酮，考察了提取工藝參數(shù)，為裸花紫珠制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-1600紫外分光光度計(jì)(天津拓普) 。AB-8 和D-101大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司，批號(hào)分別為20100825，20101106)，HP-20和HP2MG(日本三菱公司，批號(hào)分別為20101203，20101015)，蘆丁(供含量測(cè)定用，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-200707)，其他試劑均為分析純。裸花紫珠水提取浸膏由海南九芝堂藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)：20120302)，浸膏含水量為39.2%。

2 方法與結(jié)果

2.1 裸花紫珠總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，置50 mL量瓶中，加60%乙醇溶解并稀釋到刻度，得蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取0，1，2，3，4，5，6 mL蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以第1管為空白對(duì)照，在507 nm波長處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=15.223C+0.000 2，r=0.999 1，蘆丁在8～48 μg·mL-1呈良好線性關(guān)系。

2.1.2 樣品測(cè)定 取裸花紫珠各樣品溶液(粗提液或洗脫液)，精密吸取適量溶液(1～6 mL)，照“2.1.1”項(xiàng)下方法，自“分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL”開始操作，測(cè)定各樣品溶液的A值，根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮濃度[4]。

2.2 裸花紫珠提取物的處理 裸花紫珠水提浸膏用10倍質(zhì)量的65%乙醇浸泡，放置過夜，抽濾，用適量65%乙醇洗滌濾渣，合并濾液，減壓蒸至無醇味，備用。測(cè)得裸花紫珠醇沉物的總黃酮含量為15.6%。醇沉浸膏臨用前用適量熱純化水稀釋。

2.3 樹脂的預(yù)處理 分別取商品大孔吸附樹脂AB-8、D-101、HP-20、HP2MG型大孔樹脂適量，于燒杯中加適量純化水浸泡24 h，2 mol·L-1鹽酸浸泡12 h，再用純化水洗至中性，2 mol·L-1氫氧化鈉溶液浸泡12 h，純化水洗至中性。最后用95%乙醇浸泡24 h，上柱，用95%乙醇洗脫，直至流出液和水混合無白色渾濁，再洗至無醇味[5]，備用。

2.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 取處理好的濕樹脂AB-8 、D-101、HP-20、HP2MG各10.0 mL(濕體積，下同)，置于4 只250 mL 錐形瓶，加入總黃酮濃度為13.39 mg·mL-1(相當(dāng)于生藥材濃度為0.5 g·mL-1)的裸花紫珠醇沉物溶液100 mL，不停振搖24 h，濾過，用20 mL純水洗滌樹脂，洗液與濾液合并，測(cè)濾液中總黃酮含量，計(jì)算吸附量和吸附率。再加95%乙醇100 mL，振搖，放置24 h，使樹脂解吸附，濾過，樹脂用適量95%乙醇洗滌，合并濾液，測(cè)定溶液中總黃酮濃度，計(jì)算解析量和解析率。

吸附量=(吸附前樣品溶液的總黃酮量-吸附后樣品溶液中總黃酮量)/樹脂體積；吸附率(%)=(上樣液中總黃酮的量-吸附后樣品溶液中總黃酮量)/上樣液中總黃酮的量×100%；解吸量=(乙醇洗脫液中總黃酮的濃度×乙醇洗脫液的體積)/樹脂體積；解吸率(%)=解吸量/解吸量×100%。結(jié)果見表1。

表1 4種樹脂對(duì)裸花紫珠總黃酮的靜態(tài)吸附

Tab.1 Static adsorption of total flavonoids fromCallicarpanudifloraHook.et Arn by four kinds of resins

樹脂類型吸附量/(mg·mL-1)吸附率/%解吸量/(mg·mL-1)解吸率/%AB-812.345.812.097.8D-10118.669.415.784.3HP-2020.174.919.396.3HP2MG18.468.817.695.5

2.5 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 取處理好的濕樹脂AB-8 、D-101、HP-20、HP2MG各10.0 mL，分別置于4 只玻璃層析柱中，加入總黃酮濃度為13.39 mg·mL-1的裸花紫珠醇沉物溶液，以1 BV流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，流出液每10 mL接收一份，每一份取適量，用鹽酸-鎂粉反應(yīng)，并輔以TLC 薄層檢測(cè)流出液的黃酮類化合物，待鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈陽性時(shí)，停止上樣，記錄上樣量，用4 BV 水洗，收集水洗液，測(cè)定溶液中總黃酮的含量。再用95%乙醇洗脫，洗至洗液近無色，收集洗脫液于1 000 mL量瓶中，定容，測(cè)定溶液中總黃酮的含量。計(jì)算吸附量、吸附率、解析量和解析率。結(jié)果見表2。

表2 4種樹脂對(duì)裸花紫珠總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附

Tab.2 Dynamic adsorption of total flavonoids fromCallicarpanudifloraHook.et Arn by four kinds of resins

樹脂類型吸附量/(mg·g-1)吸附率/%解吸量/(mg·g-1)解析率/%AB-810.840.310.294.4D-10117.665.714.481.9HP-2019.472.417.992.3HP2MG17.364.716.494.4

由表1，2可知，4種型號(hào)樹脂中HP-20和HP2MG大孔吸附樹脂的吸附率較大，而且其靜態(tài)解吸率>95%，從動(dòng)態(tài)吸附數(shù)據(jù)看出，HP-20的吸附率最高，結(jié)合樹脂成本和工藝的可操作性，選擇HP-20型大孔吸附樹脂。

2.6 上樣溶液pH的考察 黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，因此pH 對(duì)其吸附性能有一定影響。本實(shí)驗(yàn)考察pH對(duì)吸附及解吸附的影響。分別將總黃酮濃度為13.39 mg·mL-1的裸花紫珠醇沉物溶液用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至1.0，3.0，5.0，7.0，9.0。按“2.4”項(xiàng)同法操作，測(cè)定HP-20樹脂的吸附率和解吸率，結(jié)果見表3?？梢?，隨著pH的升高，總黃酮吸附率下降，在pH為1.0～3.0時(shí)，吸附率達(dá)到最大，且pH1.0和pH3.0之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是在低pH階段，黃酮呈分子型，有利于其吸附。考慮到酸性太強(qiáng)對(duì)設(shè)備的腐蝕和對(duì)環(huán)境的影響較大，故設(shè)計(jì)將裸花紫珠上柱液pH調(diào)至3.0。

表3 pH對(duì)吸附的影響

2.7 動(dòng)態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn) 將裸花紫珠提取樣品溶液調(diào)節(jié)pH至3.0，以一定流速通過裝有HP-20樹脂的層析柱，測(cè)定流出液中黃酮類化合物濃度，繪制樹脂泄漏曲線。考察樣品溶液上柱濃度、上樣量等因素對(duì)樹脂吸附性能的影響。

以不同濃度乙醇對(duì)已吸附樣品的樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，考察最佳乙醇濃度、最佳洗脫體積等因素對(duì)樹脂解吸性能的影響，測(cè)定不同條件下解吸液中黃酮類化合物的濃度，確定最佳解吸條件。

2.7.1 樣品溶液濃度考察 將13.39 mg·mL-1樣品溶液100 mL 分別用純化水稀釋2 倍(6.70 mg·mL-1)、3 倍(4.46 mg·mL-1)、4 倍(3.35 mg·mL-1)、5 倍(2.68 mg·mL-1)，調(diào)節(jié)pH為3.0，分別通過5 根裝有HP-20大孔吸附樹脂20.0 mL的層析柱，流速2 BV·h-1，收集流出液，測(cè)定溶液總黃酮含量，結(jié)果13.39，6.70，4.46，3.35，2.68 mg·mL-1樣品溶液的吸附量分別為9.83，14.03，16.46，15.76，11.77 mg·mL-1，樹脂吸附量與樣品溶液濃度和體積有一定關(guān)系。在初始階段，樣品濃度降低，吸附量增大，隨后隨著樣品濃度的下降，吸附率反而降低。用HP-20大孔樹脂吸附裸花紫珠粗提液中的總黃酮，樣品溶液濃度為4.46 mg·mL-1時(shí)樹脂對(duì)黃酮吸附量最大，考慮到樣品濃度過低上樣時(shí)間也延長，故確定4.46 mg·mL-1為上樣溶液濃度。

2.7.2 上樣量的考察 將一定量4.46 mg·mL-1樣品溶液，調(diào)節(jié)pH為3.0，以2 BV·h-1流速通過裝有HP-20大孔吸附樹脂20 mL的層析柱，流出液每20 mL收集一次，測(cè)定各份流出液中總黃酮濃度，繪制泄漏曲線，結(jié)果見圖1。當(dāng)上樣量為380 mL時(shí)，流出液中總黃酮含量處在迅速增大的拐點(diǎn)，所以用HP-20大孔吸附樹脂分離裸花紫珠提取液中的總黃酮時(shí)，最佳上樣量為380 mL，約為樹脂體積的19倍。

圖1 泄漏曲線

2.7.3 上樣流速考察 取pH為3.0的4.46 mg·mL-1的裸花紫珠提取液4份，每份380 mL，通過大孔樹脂色譜柱(樹脂體積20 mL，徑高比1：8)，分別以流速為2，3，4 BV·h-1上樣，收集上樣流出液，測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果流速為2，3，4 BV·h-1上樣時(shí)，對(duì)應(yīng)的流出液中總黃酮含量分別為0.373，0.386，0.992 mg·mL-1。結(jié)果表明當(dāng)上樣流速達(dá)到4 BV·h-1時(shí)，流出液中總黃酮含量明顯增高。為了保證吸附完全和節(jié)省時(shí)間，選擇上樣流速為3 BV·h-1。

2.7.4 水洗體積考察 取pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液380 mL，通過大孔樹脂色譜柱(樹脂體積20 mL，徑高比1：8)，分別以3 BV·h-1的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，然后水洗除雜，每一0.5 BV收集一份水提液，用鹽酸-鎂粉反應(yīng)，并輔以薄層色譜檢測(cè)流出液的黃酮類化合物，結(jié)果顯示水洗液中未檢出總黃酮，至3 BV時(shí)，洗出液溶液顏色近無色，為防止總黃酮流失和節(jié)省時(shí)間，故確定水洗除雜體積為3 BV。

2.7.5 洗脫乙醇濃度考察 取已處理的HP-20型吸附樹脂5 份，每份20 mL，分別加pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液380 mL，以3 BV·h-1流速上樣，用3 BV水以3 BV·h-1水洗，再分別用10%，30%，50%，75%，95%乙醇各40 mL，以1 BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，分別收集洗脫液，20 mL為一瓶，測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果吸附率分別為78.2%，79.3%，77.7%，79.4%，79.5%；洗脫率依次為18.2%，67.5%，70.4%，92.3%，96.4%。結(jié)果說明隨乙醇濃度的增大，洗脫率逐漸增大，到75%以后，洗脫率基本穩(wěn)定在92%以上，從節(jié)約成本角度出發(fā)確定洗脫液濃度為75%。

2.7.6 洗脫速率考察 取已處理的HP-20型吸附樹脂5 份，每份20 mL，分別加pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液380 mL，以3 BV·h-1流速上樣，以3 BV·h-1水洗，再用75%乙醇分別以1，2，3 BV·h-1流速洗脫，收集過柱液并記錄體積，測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果總黃酮吸附率分別為79.2%，76.8%，79.4%；洗脫率依次為93.3%，92.0%，87.8%。說明洗脫速率對(duì)樹脂的洗脫率有一定影響，1 和2 BV·h-1之間并不很明顯，故確定最佳洗脫速率為2 BV·h-1。

2.7.7 洗脫曲線的繪制 取已處理的HP-20型吸附樹脂20 mL，分別加pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液380 mL，以3 BV·h-1流速上樣，用3 BV水以3 BV·h-1水洗，用濃度為75%乙醇溶液，以2 BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，每10 mL收集1份洗脫液，測(cè)定總黃酮含量，繪制洗脫曲線，見圖2。4 BV終點(diǎn)已經(jīng)檢測(cè)不出總黃酮。

圖2 總黃酮洗脫曲線

2.7.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取已處理的HP-20型吸附樹脂40 mL，分別加pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液720 mL，以3 BV·h-1流速上樣，以3 BV·h-1水洗，用濃度為75%乙醇溶液，以2 BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，50 ℃減壓回收乙醇，60 ℃減壓干燥成干浸膏，測(cè)定浸膏中總黃酮含量，計(jì)算總黃酮回收率及含量，見表4。其中回收率(%)=浸膏中總黃酮的量/上樣液中總黃酮的量×100%；含量(%)=浸膏中總黃酮的量/浸膏的質(zhì)量×100%。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

Tab.4 Verification test %

2.7.9 樹脂重復(fù)使用實(shí)驗(yàn) 用新處理的同一根樹脂柱，按以上確定的工藝上樣、水洗、乙醇洗脫，用4 BV純水沖洗樹脂柱后，重復(fù)以上操作6次，測(cè)定總黃酮回收率和含量。見表5，可見樹脂重復(fù)使用4次以后總黃酮回收率急劇降低，因此確定樹脂重復(fù)使用4次就需要再生處理。

表5 樹脂重復(fù)使用實(shí)驗(yàn)

Tab.5 Test of resin reuse %

本實(shí)驗(yàn)選用HP-20大孔吸附樹脂分離裸花紫珠總黃酮，純化裸花紫珠的工藝為pH為3.0的4.46 mg·mL-1裸花紫珠提取液720 mL，以3 BV·h-1流速上樣，以3 BV·h-1水洗，用濃度為75%乙醇溶液，以2 BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，洗脫率可達(dá)94%，總黃酮含量平均提高3.1倍，達(dá)到47.4%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)方法分離裸花紫珠總黃酮的含量離《藥品注冊(cè)管理辦法》附件規(guī)定的“有效部位含量應(yīng)占提取物的50%以上”尚有一定的差距。從本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)來看，若想提高含量可提高水洗量，或用低濃度乙醇洗脫，然而這樣會(huì)導(dǎo)致總黃酮損失過多，回收率降低，因此要想進(jìn)一步提高裸花紫珠總黃酮含量需要進(jìn)一步篩選對(duì)黃酮具有更好特異性的樹脂，或者將總黃酮粗品用溶劑萃取(如石油醚脫脂)后再上柱分離[6]。

[1] 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物資源開發(fā)研究所，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，等.中藥志[M].第5 冊(cè).北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：147.

[2] 高飛鵬，汪豪，葉文才，等.裸花紫珠葉的化學(xué)成分[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(2)：120-122.

[3] 蔡金平，董琳，關(guān)薇薇.裸花紫珠的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2012，27(1)：60-61.

[4] 諶樂剛，宋永強(qiáng).分光光度法測(cè)定裸花紫珠藥材水提物中總黃酮的含量[J].華西藥學(xué)雜志，2005，20(5)：449-450.

[5] 朱浩，毛聲俊.大孔樹脂吸附純化不同中藥有效部位特性研究[J].中國中藥雜志，1998，2(10) ：607-609.

[6] 桑林，王曉林，鐘方麗.大孔吸附樹脂純化獨(dú)活總黃酮的工藝優(yōu)選[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(6)：57-60.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.020

Optimization of Purification Technology for Total Flavonoids fromCallicarpanudifloraHook.et Arn.by Macroporous Adsorption Resin

LIU Yong1, ZHANG Pengwei2, SU Wenqin2, LIU Xiao3, GONG Keming4, XIANG Ni2

(1.DepartmentofPharmacy,theSecondHospitalAffiliatedtoWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China；2.SchoolofPharmacy,HainanMedicalUniversity,Haikou571199,China; 3.WenzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wenzhou325000,China; 4.YanchengInstituteofHealthSciences,Yancheng224005,China)

Objective To optimize purification technology for total flavonoids inCallicarpanudifloraHook.et Arm.by macroporous adsorption resin. Methods Macroporous resin models including AB-8, D-101, HP-20, HP2MG, were optimized by static adsorption and desorption experiments regarding to adsorption rate and desorption rate of total flavonoids.Purification technology parameters of total flavonoids were optimized by single factor test. Results HP-20 macroporous resin presented the best purification efficiency，the optimum purification conditions were that taking 4.46 mg·mL-1of total flavonoidsat pH 3.0,loading at 3 BV·h-1, washed with 3BV of water at 3 BV·h-1,then eluted with 4 BV 75% ethanol at 2 BV·h-1, finally obtaining the total flavonoids from the dry extract ofCallicarpanudifloraHook.et Arn.with the purity of 47.4%. Conclusion HP-20 macroporous resin is suitable for preliminary purification of total flavonoids inCallicarpanudifloraHook.et Arn.

CallicarpanudifloraHook.et Arn.; Total flavonoids; Macroporous Adsorption Resin

2014-01-06

2014-03-24

*海南省重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZDXM20120095)；浙江省公益技術(shù)研究社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(2012C23082)；海南醫(yī)學(xué)院科研培育基金(HY2010-011)

劉勇(1974-)，男，浙江溫州人，藥師，碩士，主要從事中藥制劑開發(fā)。電話：0577-88002568，E-mail：153334048@qq.com。

張鵬威(1975-)，男，湖北羅田人，副教授，博士，主要從事藥物制劑開發(fā)和藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。電話：0898-66894429，E-mail：zpw0803@163.com。

R282.71；TQ460.6

B

1004-0781(2015)05-0640-04