摘要：為了解膽酸鹽濃度、作用時間兩種因素對亞硝基谷胱甘肽——GSNO處理雞柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）孢子化卵囊脫囊的影響，試驗采用L9（34）正交試驗方法，通過鏡檢子孢子脫囊率來確定雞球蟲卵囊經(jīng)GSNO處理后體外脫囊的最佳條件。結(jié)果表明，在膽酸鹽濃度為0.75%，作用時間為2 h時，GSNO處理孢子化卵囊的脫囊率最高。

關鍵詞：亞硝基谷胱甘肽；柔嫩艾美耳球蟲；脫囊

中圖分類號：S831；S852.72+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2173-03

雞球蟲病是現(xiàn)代規(guī)模養(yǎng)禽業(yè)中最常見、最難凈化且危害嚴重的寄生蟲病之一，由于球蟲病在雞各個生長階段的發(fā)病率和致死率都比較高，因而給養(yǎng)雞業(yè)帶來了很大的沖擊，全球每年因球蟲病造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)10億美元[1]，同時，抗球蟲藥的廣泛使用所引起的藥物殘留已成為影響人類健康的巨大隱患，因此能否有效控制雞球蟲病顯得意義重大。

Allen于1998年首次發(fā)現(xiàn)感染E.tenella的雛雞體內(nèi)NO水平明顯高于未感染的對照組[2]，傅小平等[3]研究也得出相同結(jié)論，這提示NO可能參與了球蟲感染的過程，并在抗球蟲感染中發(fā)揮著重要作用。由于NO的理化性質(zhì)極不穩(wěn)定，很難直接利用NO或NO的溶液對其特性進行研究，而利用NO供體來模擬NO活性是研究NO的一種重要手段[4]。有研究表明[5]，S-亞硝基硫醇類NO供體（GSNO）可以不可逆地抑制柔嫩艾美耳球蟲未成熟卵囊的孢子生殖，其抑制率高達100%。動物試驗也表明，GSNO處理可以明顯降低孢子化E.tenella卵囊對雛雞的致病力[6]。本研究采用體外脫囊正交試驗方法，通過鏡檢子孢子脫囊率來評價GSNO處理孢子化卵囊體外脫囊的最佳條件，從而進一步探討GSNO對雞球蟲卵囊的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲株

柔嫩艾美耳球蟲卵囊，揚州大學獸醫(yī)學院寄生蟲學實驗室保存株，經(jīng)雛雞傳代獲取新鮮的未孢子化卵囊，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹8]。

1.2 主要試劑

還原型谷胱甘肽、胰酶（上海金穗生物科技有限公司），亞硝酸鈉（無錫市晶科化工有限公司），牛膽酸鹽（Ward blenkinsop Co LTD）。

GSNO：亞硝基硫醇類（RSNO）NO供體，依照Stefan F[7]介紹的方法制備。

1.3 方法

1.3.1 孢子化卵囊的準備 將分離的未孢子化卵囊加入2.5%重鉻酸鉀溶液于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行孢子生殖，待95%左右的卵囊出現(xiàn)斯氏體[9]后，收集孢子化卵囊，用滅菌水洗滌并離心[10]，重復3次以除去重鉻酸鉀溶液。

1.3.2 卵囊的前處理 取新鮮的孢子化卵囊，將其分成3組，用0、8、16 mmol/L的GSNO在4 ℃冰箱處理8 h，離心3次棄去GSNO，不同GSNO處理再分成3組，用研磨器研磨上述9組不同處理的卵囊，直至90%左右的孢子囊從卵囊壁游離出來，離心3次調(diào)整各組孢子囊濃度為60×105個/mL。

1.3.3 體外脫囊試驗 為確定膽酸鹽濃度和消化液作用時間對GSNO處理孢子化卵囊脫囊試驗的影響，采用L9（34）正交試驗設計方案，各因素每個水平設置6個重復，以計算的子孢子脫囊率為指標來考察子孢子脫囊的最佳條件，因素與水平見表1。在上述9組孢子囊中分別加入不同處理的消化液，按下表內(nèi)容進行操作，40 ℃消化不同時間后在顯微鏡下記錄子孢子數(shù)，計算子孢子脫囊率。子孢子脫囊率的公式為：子孢子脫囊率=子孢子數(shù)/（子孢子數(shù)+孢子囊數(shù)×2）×100%[11]。

1.4 統(tǒng)計學處理

試驗結(jié)果均采用SPSS軟件進行方差分析，比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

從表2可知，各因素水平的優(yōu)劣順序是：B1>B3>B2，C3>C2>C1。0.75%的膽酸鹽濃度使球蟲子孢子更易從孢子囊中脫出，消化液與孢子化卵囊作用時間越長，子孢子脫囊越完全。

由表3結(jié)合F值表可知，F(xiàn)0.05（2，42）=3.22，F(xiàn)0.01（2，42）=5.15。FB（3.431）>F0.05，表明B因素的各水平差異顯著（P<0.05）；FC（5.063）>F0.05，表明C因素的各水平差異顯著（P<0.05），這說明膽酸鹽濃度和消化液處理卵囊時間對GSNO處理孢子化卵囊的脫囊有顯著影響。

方差分析表明，膽酸鹽濃度（B）、作用時間（C）對GSNO處理孢子化卵囊的主次順序為：C>B，即：消化液處理卵囊時間越長，子孢子脫囊率越高。由于各因素間沒有交互作用，各因素效應可相加，故B與C最佳水平的組合也是最佳的，對于GSNO處理孢子化卵囊的脫囊率最高的組合為B1C3，即膽酸鹽濃度0.75%，消化液作用時間為2 h時，子孢子脫囊最徹底。

3 討論

柔嫩艾美耳球蟲的卵囊壁是一個堅固的化學結(jié)構，并且能夠耐受機械性損傷，卵囊對于化學制品、消化酶、洗滌液以及低滲溶液的破壞具有相當?shù)牡挚沽?，常?guī)的消毒劑很難破壞球蟲的卵囊壁結(jié)構。對于成熟的孢子化的卵囊，必須采用特殊的機械方法才能在某種程度上破壞卵囊壁，本試驗研究表明，采用研磨器機械破碎的方法對于卵囊壁的破裂能夠取得較好的效果。

體外脫囊試驗進一步評價了GSNO對于孢子化卵囊的體外消毒效果，邢濤等[12]研究表明經(jīng)GSNO處理的孢子化卵囊的脫囊減少率均值為20.8%；李金貴等[6]報道GSNO可以不可逆地抑制未成熟卵囊的孢子生殖，其抑制率高達100%，這提示球蟲的卵囊壁在卵囊成熟前后可能發(fā)生了形態(tài)或生理上的變化，可能對GSNO處理具有一定的保護作用。

本試驗研究結(jié)果表明，膽酸鹽濃度為0.75%，作用時間為2 h時，GSNO處理孢子化卵囊的子孢子脫囊率最高。膽酸鹽濃度與其他文獻的報道相一致，而脫囊液作用時間則比其他文獻報道的時間長[13]，這表明消化液處理時間越長子孢子脫囊越完全。endprint

在本試驗中，對于16 mmol/L GSNO處理的成熟孢子化卵囊，其子孢子脫囊率的均值為43.72%，而未經(jīng)任何處理的卵囊其脫囊率高達96.69%[11]，該結(jié)果表明GSNO能在一定程度上抑制雞柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊的脫囊，這提示GSNO在預防和控制雞球蟲病方面有廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1] LILLEHOJ H S， LILLEHOJ E P. A review of acquired intestinal immunity and vaccination strategies[J].Avian Dis， 2000， 44：408-425.

[2] ALLEN P C， LILLENHOJH S. Genetic influence on nitric oxide peoduction during E. tenella infections in chickens[J]. Avian Dis， 1998，42 （2）：397-403.

[3] 傅小平，李 銀，沈永林，等.一氧化氮（NO）在雞感染柔嫩艾美耳球蟲中的作用[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2001，24（3）：77-78.

[4] 江 燕，張宏學，李金貴，等.外源性一氧化氮對雞柔嫩艾美耳球蟲的作用[J].畜牧與獸醫(yī)，2005，37（4）：6-8.

[5] LI J G， LIU Z P， TAO J P. The effects of nitric oxide donors on the sporulation of Eimeria tenella oocysts[J].Veterinary Parasitology，2008，154：336-340.

[6] LI J G ， XING T ， WANG L ， et al. Inhibitory effect of S-nitroso-glutathione on Eimeria tenella oocysts was mainly limited to the early stages of sporogony[J]. Veterinary Parasitology， 2010， 173：64-69.

[7] STEFAN，BIRGIT S，HEIKO K. Differential regulation of vascular endothelial growth factor and its receptor fms-like-tyrosine kinase is mediated by nitric oxide in rat renal mesangial cells [J]. Biochem J，1999，338：367-374.

[8] 索 勛，李國清.雞球蟲病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社， 1998. 385.

[9] 王中寶，歐俊秀，曾明華，等.安徽部分地區(qū)雞柔嫩艾美耳球蟲單卵囊的分離與鑒定[J].吉林農(nóng)業(yè)科學，2013，38（1）：50-53.

[10] 宋 萍，馬慶濤，蘇洋洋，等.青蒿素類藥物對雞柔嫩艾美耳球蟲感染的防治試驗[J].中國家禽，2014，36（5）：40-41.

[11] 吳惠賢，魏文康，謝宏料等.判斷消毒劑對雞球蟲孢子化卵囊抑殺效果的新方法——脫囊抑制試驗[J].中國獸醫(yī)學報，1998， 18（6）：619-620.

[12] 邢 濤，李金貴，陶建平.GSNO對孢子化卵囊、孢子囊活力及致病力的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，41（9）：91-93.

[13] 孟慶玲，才學鵬，田廣孚，等.斯氏艾美耳球蟲孢子生殖及其致病性研究[J].中國病原生物學雜志，2007，2（3）：183-185.endprint