張立海，王 嬌，陳福軍，鐘 敏，金 松，王桂梅，王亞洲，王躍生

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外一科，黑龍江 佳木斯 154003)

去乙酰化胃腸激素聯(lián)合G-CSF及bFGF促進(jìn)糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的研究①

張立海，王 嬌，陳福軍，鐘 敏，金 松，王桂梅，王亞洲，王躍生

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外一科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：研究去乙?；改c激素(UAG)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)聯(lián)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)對(duì)糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的促進(jìn)作用及作用機(jī)制。方法：以120例Wistar大鼠為研究對(duì)象，隨機(jī)將其劃分為A、B、C三組，并將每組40例進(jìn)一步劃分出組1、組2，各組1均為正常后肢缺血模型、組2均為糖尿病后肢缺血模型。A1、A2組不予藥物干預(yù)；B1、B2組予G-CSF聯(lián)合bFGF干預(yù)；C1、C2組予UAG、G-CSF聯(lián)合bFGF干預(yù)。術(shù)后1周，每組取10只大鼠，檢測(cè)缺血區(qū)組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)；術(shù)后4周，余大鼠行激光多普勒檢測(cè)后肢肌肉血流后，處死并檢測(cè)缺血區(qū)組織毛細(xì)血管數(shù)量。結(jié)果：MMP-9及VEGF表達(dá)均呈現(xiàn)C組>B組>A組、各組1>各組2趨勢(shì)，且C組與A組、B組與A組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)C2組MMP-9及VEGF表達(dá)均明顯高于B2組(P<0.05)；組內(nèi)對(duì)比，A1、B1組分別明顯高于A2、B2組(P<0.05)。肌肉血流及毛細(xì)血管數(shù)量亦呈現(xiàn)C組>B組>A組、各組1>各組2趨勢(shì)，且C1組與A1組，B1組與A1組，C2、B2、A2間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組內(nèi)對(duì)比A1、B1組分別明顯高于A2、B2組(P<0.05)。結(jié)論：UAG聯(lián)合G-CSF與bFGF可有效促進(jìn)糖尿病大鼠缺血后肢血管新生，其機(jī)制可能與促進(jìn)MMP-9、VEGF的表達(dá)有關(guān)。

糖尿??；肢體缺血；血管新生；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

WHO預(yù)測(cè)，2025年世界范圍內(nèi)糖尿病患者可能達(dá)到3億，將嚴(yán)重影響居民生活質(zhì)量[1]。糖尿病所致各種并發(fā)癥為其主要威脅，其中又以下肢缺血性病變較為常見，可進(jìn)一步致死致殘，較具威脅?，F(xiàn)階段對(duì)其的研究重點(diǎn)集中于促進(jìn)血管新生，恢復(fù)下肢血流灌注，但糖尿病患者糖脂代謝紊亂、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，常規(guī)促血管新生藥物可能難以發(fā)揮作用[2]。G-CSF能夠刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化[3]；局部應(yīng)用bFGF則有助于改善局部細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向缺血組織趨化[4]；UAG有助于修復(fù)糖尿病患者EPC的活化缺陷。上述藥物聯(lián)用可能有助于缺血部位的血管新生，但尚需實(shí)驗(yàn)探究，故我們開展本動(dòng)物學(xué)研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

雄性Wistar大鼠120只，均購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，年齡10～12個(gè)月，體重250～280g；鏈脲菌素(上海巖生)、水合氯醛(上海巖生)、UAG(美國(guó)BioLegend)、bFGF(美國(guó)Sigma)、G-CSF(美國(guó)Sigma)、MMP-9酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德)、VEGF酶聯(lián)免疫試劑盒(上海森林雄科)、CD34酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德)等；石蠟切片機(jī)(武漢博士德)、激光多普勒超聲儀(瑞典百靈威)、酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek)等。

1.2 方法

1.2.1 分組方法：所有大鼠按體重編號(hào)，行隨機(jī)數(shù)字表法多層分組。首先分為A、B、C三組，每組40只；隨后各組劃分出組1、組2，各20例。共得A1、A2、B1、B2、C1、C2六組。

1.2.2 造模方法：各組1均制備糖尿病模型：禁食12h，腹腔注射鏈脲菌素(60mg/kg，溶于我院自制檸檬酸緩沖液)。一周后采集尾靜脈血，空腹血糖超過(guò)300mg/dL說(shuō)明造模成功。所有大鼠均制備后肢缺血模型：術(shù)前禁食12h、常規(guī)進(jìn)水，戊巴比妥腹腔麻醉，仰臥固定于恒溫操作臺(tái)；右側(cè)腹股溝做切口，至膝關(guān)節(jié)，分離肌層；隨后暴露并分離股動(dòng)脈，結(jié)扎、電灼，切除下段及分支。

1.2.3 用藥方法：待模型建立完畢后，間隔6h開始給藥，藥物劑量：UAG隔日1次，每次腹腔注射30μmol/kg；G-CSF首7日每日一次，皮下注射10μg/kg；bFGF首7日隔日1次，共4次，缺血區(qū)肌注5μg/kg。A組予等量生理鹽水，參考上述劑量注射；B組予G-CSF聯(lián)合bFGF，按照上述計(jì)量注射；C組在B組基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用UAG。

1.2.4 觀察項(xiàng)目：常規(guī)觀察大鼠體重、毛色、大小便、后肢運(yùn)動(dòng)情況等；模型建立1周后，各組取10只大鼠，處死，取缺血區(qū)肌肉組織2g，分兩份，分別用于檢測(cè)MMP-9及VEGF，均采取ELISA檢測(cè)法，操作步驟嚴(yán)格參照試劑說(shuō)明書；模型建立4周后，行多普勒超聲檢測(cè)余大鼠下肢血流，隨后處死，取缺血區(qū)組織，固定、包埋、切片后行ELISA法檢測(cè)CD34陽(yáng)性血管數(shù)，以評(píng)價(jià)大鼠微血管數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

P<0.05為差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MMP-9及VEGF表達(dá)對(duì)比

兩者表達(dá)一般趨勢(shì)均為：C組>B組>A組，且各組1>各組2。A、B、C三組間MMP-9水平行q檢驗(yàn)指出B1、C1組均明顯高于A1組(q=4.31，4.33；P<0.05)，B2、C2均明顯高于A2組(q=3.82，4.58；P<0.05)，C2明顯高于B2(q=4.28；P<0.05)；A、B、C三組組內(nèi)對(duì)比，A1、B1分別明顯高于A2、B2組。其他項(xiàng)對(duì)比，未見明顯差異。VEGF表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果相同。見表1。

表1 大鼠MMP-9及VEGF表達(dá)對(duì)比

2.2 肌肉血流及微血管密度對(duì)比

兩指標(biāo)一般趨勢(shì)亦為：C組>B組>A組，且各組1>各組2。A、B、C三組間肌肉血流PU值行q檢驗(yàn)指出C1組、B1組均明顯高于A1組(q=4.05，4.97；P<0.05)，B2、C2均明顯高于A2組(q=3.47，3.99；P<0.05)，C2明顯高于B2(q=4.05；P<0.05)；A、B、C三組組內(nèi)對(duì)比，A1、B1均明顯高于A2、B2組。其他項(xiàng)對(duì)比，未見明顯差異。微血管密度統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果相同。見表2。

表2 肌肉血流及微血管密度對(duì)比±s)

3 討論

有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植有助于促進(jìn)糖尿病大鼠后肢缺血血管的新生，這可能是因?yàn)橐浦驳母杉?xì)胞中富含內(nèi)皮祖細(xì)胞，其作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，能夠迅速分化為血管內(nèi)皮，進(jìn)而使血管新生[5，6]。本研究借鑒該結(jié)論，但試圖僅通過(guò)藥物注射達(dá)到相似的效果，對(duì)照組應(yīng)用的G-CSF，能夠提升循環(huán)系統(tǒng)中內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，該藥物為骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑，早期研究證實(shí)其能夠作用于中性粒細(xì)胞系，刺激粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞成熟并向外周血釋放，近期亦有研究表明其能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增生，從而保證血管新生具有細(xì)胞基礎(chǔ)[7]；在此基礎(chǔ)上，對(duì)照組同時(shí)局部應(yīng)用bFGF，其為促有絲分裂因子[8]，亦能誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生和分化，能夠?yàn)閮?nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向缺血區(qū)域趨化、歸巢，能夠提升靶向性，抑制其它組織的血管再生。本例中B組僅采用上述兩藥物聯(lián)用，對(duì)糖尿病及非糖尿病后肢缺血模型均有一定作用，但B組組內(nèi)對(duì)比，亦可表明，B1作用效果明顯優(yōu)于B2。這可能是由于糖尿病患者內(nèi)皮祖細(xì)胞及早期循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員受損所致。研究指出，內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員與血管內(nèi)皮因子及MMP-9相關(guān)[9]，前者為血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，與受體結(jié)合后，能夠選擇性地促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分裂增殖，為血管形成提供基質(zhì)；后者則有助于膜結(jié)合型配體向松散型配體轉(zhuǎn)化。本例A1、B1組中MMP-9及VEGF的表達(dá)均明顯高于A2、B2組，能夠直接證實(shí)糖尿病患者血管新生能力明顯降低，術(shù)后4周觀察肌肉血流及微血管數(shù)量，亦證實(shí)G-CSF聯(lián)合bFGF的療效尚需提升。

本研究結(jié)果同時(shí)能證實(shí)，在上述兩類藥物的基礎(chǔ)上，聯(lián)用UAG可能達(dá)到更佳的療效，C2組大鼠MMP-9及VEGF水平均明顯高于B2組，與之一致，其術(shù)后4周肌肉血流及微血管數(shù)量亦明顯高于B2組。這可能說(shuō)明UAG有助于修復(fù)糖尿病患者EPC活化的缺陷。既往有研究指出該藥物能夠抑制p53及p21的表達(dá)與堆積[10]，后兩者均為調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的主要因子，大量堆積將導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞老化、血管再生能力下降。經(jīng)過(guò)輸注UAG后，C1、C2組MMP-9及VEGF的表達(dá)量大體一致，能夠說(shuō)明大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖與動(dòng)員能力已恢復(fù)至無(wú)糖尿病水平[11]；但C1組與B1組MMP-9與VEGF的表達(dá)基本一致，則提示在正常人群中，UAG可能無(wú)法繼續(xù)修復(fù)內(nèi)皮祖細(xì)胞活化的缺陷，因此可以認(rèn)為，對(duì)UAG僅適用于糖尿病相關(guān)下肢缺血癥狀的治療，在其它下肢缺血癥狀中的療效及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究[12]?？傊?，本研究說(shuō)明G-CSF聯(lián)合bFGF能夠?qū)崿F(xiàn)下肢缺血癥狀的血管再生，而對(duì)合并糖尿病患者，進(jìn)一步聯(lián)用UAG能夠顯著提升療效。

[1]劉蔚,周翔海.用糖化血紅蛋白診斷糖尿病——WHO咨詢報(bào)告[J].中國(guó)糖尿病雜志,2011,19(1):2-10

[2]劉志國(guó).糖尿病足潰瘍?cè)\治進(jìn)展[J].中華損傷與修復(fù)雜志(電子版),2012,07(2):68-70

[3]JingYu,JunRen,Li-jundi,etal.MobilizationofPeripheralBloodStemCellsUsingRegimenCombiningDocetaxelwithGranulocyteColony-stimulatingFactorinBreastCancerPatients[J].ChineseJournalofCancerResearch, 2011, 23(1):49-53

[4]李海輝,蔡善君,宮鑫，等.藍(lán)光對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞α1D亞基蛋白表達(dá)及分泌VEGF和bFGF的影響[J].中華眼科雜志,2014,50(11):814-819

[5]張曉梅, 徐忠燁, 朱曉峰.bFGF、EGF聯(lián)合應(yīng)用對(duì)新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2002,25(5):4-6

[6]盛寶英, 魏春杰, 楊曉玉,等.bFGF和BDNF對(duì)MCAO大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞原位增殖的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33(3)：1-2

[7]金玉玲, 張曉梅, 朱曉峰.移植神經(jīng)干細(xì)胞在腦缺血大鼠損傷腦區(qū)的定向分化及其對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2005,28(1):1-3

[8]謝曉強(qiáng),呂碧鋒,章振保，等.G-CSF動(dòng)員骨髓干細(xì)胞向缺血-再灌注腎臟歸巢并促進(jìn)腎臟修復(fù)的研究[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2012,21(5):491-496

[9]陳振波,趙儷梅,羅艷梅，等.共培養(yǎng)體系中卵巢癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞成管及MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(10):956-960

[10]ElisaDied,LaviniaCasati,FrancescaPagani,etal.AcylatedandunacylatedghrelinprotectMC3T3-E1cellsagainsttert-butylhydroperoxide-inducedoxidativeinjury:pharmacologicalcharacterizationofghrelinreceptorandpossibleepigeneticinvolvement[J].Aminoacids, 2014, 46(7): 1715-1725

[11]金松，王翰銳. 堿性成纖維生長(zhǎng)因子與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子聯(lián)合對(duì)大鼠后肢動(dòng)脈硬化閉塞血管再生作用機(jī)制的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013，36(3)：40-41

[12]金松，徐延森. 動(dòng)脈硬化閉塞癥血漿白介素-18、單核細(xì)胞趨化蛋白-1水平的觀察急臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33(3)：24-25

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：12521551。

張立海(1979～)男，黑龍江樺南人，碩士，主治醫(yī)師。

王躍生(1960～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：wys9906@163.com。

R

A

1008-0104(2015)02-0019-02

2015-01-06)