趙 樂，馬利剛，王志霜，申 業(yè)，鄭曉珂

（1河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州450046；2中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京100700）

丹參病程相關(guān)蛋白基因PR10的克隆與表達(dá)分析

趙 樂1，馬利剛1，王志霜2，申 業(yè)2，鄭曉珂1

（1河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州450046；2中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京100700）

病程相關(guān)蛋白（PR）的產(chǎn)生與積累是植物體應(yīng)對(duì)生物或非生物脅迫的主要特征之一。該研究以人工培養(yǎng)的丹參幼苗為材料，通過分析丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)丹參病程相關(guān)蛋白基因PR10的序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）從丹參中獲得PR10基因的開放閱讀框（ORF），命名為SmPR10－1（GenBank注冊號(hào)KF877034），并進(jìn)行原核表達(dá)和純化。結(jié)果表明：（1）SmPR10－1基因ORF為477bp，編碼158個(gè)氨基酸，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為17.38kD。（2）通過蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測、序列多重比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹等生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SmPR10－1基因具有保守序列（G－X－G－G－X－G）和（K－A－X－E－X－Y），其編碼蛋白與葡萄等雙子葉植物中的PR10蛋白同源性較高。（3）經(jīng)異丙基β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)，含有表達(dá)載體pET32a－SmPR10－1的大腸桿菌（Escherichia coli BL21）可誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白；對(duì)影響蛋白表達(dá)的4個(gè)因素優(yōu)化結(jié)果表明，SmPR10－1蛋白的最佳表達(dá)條件為：IPTG終濃度0.4mmol／L、起始宿主菌密度A600為0.8、誘導(dǎo)溫度30℃、誘導(dǎo)時(shí)間8h，并得到純化的SmPR10－1蛋白。該結(jié)果為進(jìn)一步研究SmPR10－1基因在丹參抗病方面的生物學(xué)功能和培育丹參抗病品種奠定了基礎(chǔ)。

丹參；病程相關(guān)蛋白；生物信息學(xué)分析；原核表達(dá)；條件優(yōu)化

植物在受到真菌、細(xì)菌和病毒等病原微生物侵染或受到非生物脅迫時(shí)會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)并積累病程相關(guān)（pathogenesis－related，PR）蛋白，這類蛋白是植物防御體系的重要組成部分［1］。PR蛋白為多基因編碼，根據(jù)氨基酸序列的相似程度、血清學(xué)關(guān)系和生物學(xué)活性，目前分為17類［2］。它們在不同的植物中表現(xiàn)為幾丁質(zhì)酶、葡聚糖苷酶、蛋白酶抑制劑、內(nèi)肽酶和過氧化物酶等，在植物自我防御機(jī)制中作為可被誘導(dǎo)的組分發(fā)揮作用。

隨著對(duì)PR蛋白研究的深入，發(fā)現(xiàn)PR蛋白不僅在被侵染組織中誘導(dǎo)表達(dá)，而在整個(gè)植株中都有表達(dá)，與系統(tǒng)獲得性抗性（systematic acquired resistance，SAR）有關(guān)，被認(rèn)為是SAR的一個(gè)顯著標(biāo)志。PR10類蛋白屬于類核糖核酸酶，可以降解RNA，有抗細(xì)菌和抗真菌的活性［3］，有關(guān)病毒［4－5］、細(xì)菌［6］、真菌［7－9］等病原菌誘導(dǎo)PR10蛋白表達(dá)的研究已有廣泛報(bào)道，作為植物防御系統(tǒng)中的可誘導(dǎo)表達(dá)組分，PR10蛋白受多種病原菌的誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)PR10蛋白在不同組織、器官及發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)，屬于組成型表達(dá)。植物激素和防御相關(guān)的信號(hào)分子，包括茉莉酸［10］、脫落酸［11］、水楊酸［12］、赤霉素、茉莉酸甲酯、乙烯也能夠調(diào)節(jié)PR10蛋白的表達(dá)。

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，以其干燥根及根莖入藥，在臨床上被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病以及各種炎癥的治療，是重要的大宗藥材，也是栽培面積較大的藥材之一。在人工栽培條件下，由于藥田生態(tài)環(huán)境中生物群落多樣性差、豐富度低，病蟲害優(yōu)勢種群突出，常常發(fā)生嚴(yán)重的病蟲害，導(dǎo)致藥材產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣，降低丹參藥用品質(zhì)，影響臨床藥效。近年來，有關(guān)丹參的研究多集中在二萜類化合物丹參酮合成途徑關(guān)鍵基因的克隆上［13－14］，而對(duì)于丹參抗病基因的研究則少有報(bào)道。

在對(duì)課題組前期得到的大量丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析中，發(fā)現(xiàn)多個(gè)植物病程相關(guān)基因，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）從丹參中得到了植物病程相關(guān)蛋白基因PR10的cDNA全長，將其構(gòu)建得到含有SmPR10－1的重組質(zhì)粒pET32a－SmPR10－1，導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中，進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、溫度等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選SmPR10－1蛋白的最適表達(dá)條件，為進(jìn)一步研究SmPR10－1基因在丹參抗病中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）種子采自陜西商洛，種植于人工氣候箱內(nèi)，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光周期為光照16h／黑暗8h，溫度25℃。種子萌發(fā)，長出4片真葉后，移至培養(yǎng)罐中，每個(gè)培養(yǎng)罐4顆幼苗，每隔3d換1次Hoagland營養(yǎng)液，培養(yǎng)60d的丹參幼苗做為實(shí)驗(yàn)材料，取根、莖、葉，樣品采集后液氮冷凍，保存于－80℃冰箱中。表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3）及原核表達(dá)載體pET－32a（＋）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 SmPR10－1基因克隆與序列分析 采用Trizol法從丹參根中提取總RNA，用NanoDrop 2000進(jìn)行含量測定，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以提取的RNA為模板，以oligo（dT）18primer為反轉(zhuǎn)錄引物，按照RevertAid H Minus Reverse Transcriptase試劑盒（Fermentas公司）說明合成cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中PR10基因的序列信息，利用Primer 5設(shè)計(jì)PR10基因編碼區(qū)的特異引物，正向引物SmPR－10－M1（5′－CGGAATTCATGGGTGTGATCA－3′，下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）；反向引物SmPR－10－M2（5′－CCGCTCGAGTGTAGTCGGGGTT－3′，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），以反轉(zhuǎn)錄得到的丹參cDNA為模板，擴(kuò)增SmPR10－1基因的ORF，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根公司）回收目的片段，將回收的PCR產(chǎn)物與pGEM－T Easy vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，在含有氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR和電泳檢測后，挑選陽性克隆送北京華大基因公司測序，將測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的PR10基因序列進(jìn)行比對(duì)，保存序列一致的陽性克隆，準(zhǔn)備構(gòu)建原核表達(dá)載體。

通過ExPASy在線服務(wù)器的Compute pI／Mw（http：／／web.expasy.org／compute＿pi／）預(yù)測SmPR10－1基因編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量與理論等電點(diǎn)，TargetP 1.1server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）預(yù)測該蛋白的亞細(xì)胞定位，SignalP 4.1server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）進(jìn)行信號(hào)肽分析，TMHMM server v.2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）進(jìn)行跨膜域分析，PredictProtein server（http：／／www.predictprotein.org／）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，SWISSMODEL（http：／／swissmodel.expasy.org／）進(jìn)行三維同源建模。用DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)，用Clustal W軟件與其他植物PR10蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，采用MEGA4軟件的相鄰連接法（neighbor－joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.2.2 SmPR10－1原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)原核表達(dá)載體pET－32a（＋）和測序正確的pGEM－T Easy－SmPR10－1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收載體片段和目的基因片段，T4DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定，挑選陽性克隆送北京華大基因公司測序。

1.2.3 SmPR10－1的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取測序正確的陽性克隆，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后，按照1∶100比例稀釋到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，220r／min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（A600為0.6），然后針對(duì)誘導(dǎo)溫度（15、20、25、30、37℃）、誘導(dǎo)時(shí)間（4、6、8、20h）、IPTG濃度（0.1、0.4、0.8、1.0mmol／L），及A600（即誘導(dǎo)起始宿主菌密度0.4、0.6、0.8、1.0）這4個(gè)影響原核表達(dá)產(chǎn)物積累的因素，當(dāng)研究其中1種因素時(shí)，固定其他3個(gè)因素不變，分別分析了這4個(gè)因素對(duì)丹參SmPR10－1重組蛋白表達(dá)的影響。

1.2.4 重組SmPR10－1蛋白的純化 根據(jù)優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件，在大腸桿菌中大量表達(dá)重組SmPR10－1蛋白，獲得菌體，超聲破碎，破碎液在4℃，12 000r／min離心30min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，采用Ni2＋親和層析方法，利用Ni Sepharose 6Fast Flow Purification System（GE Health－care）樹脂對(duì)濾液進(jìn)行純化，然后用不同濃度的咪唑梯度洗脫，SDS－PAGE電泳檢測洗脫樣品，收集單一目的條帶樣品進(jìn)行透析，透析后樣品經(jīng)超濾管濃縮，用Bradford方法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，冷凍干燥，－70℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 SmPR10－1的基因克隆與序列分析

通過對(duì)課題組前期得到的丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)PR10基因ORF設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增得到500bp左右的條帶（圖1），與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中PR10基因開放閱讀框（ORF）大小一致，測序結(jié)果表明SmPR10－1基因的OFR為477bp，編碼158個(gè)氨基酸，分子量為17.38kD，等電點(diǎn)pI為5.23。

SignalP 4.1server預(yù)測，SmPR10－1蛋白不含信號(hào)肽，TargetP 1.1server預(yù)測，顯示SmPR10－1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，TMHMM server預(yù)測該蛋白不含跨膜域。用PredictProtein對(duì)SmPR10－1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示在該蛋白中α－螺旋結(jié)構(gòu)占21.52%，β－折疊占34.81%，無規(guī)則卷曲占43.67%（圖2，A）。用SWISS－MODEL以櫻桃的allergen Pru av 1蛋白為模板（PDB ID：1e09），預(yù)測SmPR10－1蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖2，B）。結(jié)果顯示SmPR10－1蛋白包含一個(gè)C端由28個(gè)氨基酸組成的α螺旋，7個(gè)β折疊以及N端在β1和β2折疊之間的1個(gè)的短α螺旋。保守的P－loop基序（G－X－GG－X－G）位于β2和β3之間，C端有（K－A－X－E－X－Y）的保守序列（圖2，A）。三級(jí)結(jié)構(gòu)與已經(jīng)報(bào)道的PR10家族蛋白的空間結(jié)構(gòu)具有很高的相似性，β－折疊在α－螺旋間反向平行排列，構(gòu)成緊湊的α－β－α夾心結(jié)構(gòu)，具有疏水作用和穩(wěn)定的多重氫鍵，這個(gè)緊湊的結(jié)構(gòu)可能決定了PR蛋白的高穩(wěn)定性。

圖1 PCR擴(kuò)增SmPR10－1基因的開放閱讀框Fig.1 PCR amplification of SmPR10－1 gene open reading frame M.DL2000；1.SmPR10－1ORF

將SmPR 1 0－1與NCBI GenBank中2 0種植物PR10蛋白進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3）顯示，PR10聚為兩類，一類是單子葉植物PR10，另一類是雙子葉植物PR10，SmPR10－1歸屬于雙子葉植物類，與葡萄、人參親緣關(guān)系最近。

2.2 SmPR10－1基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)原核表達(dá)載體pET－32a（＋）和測序正確的pGEM－T Easy－SmPR10－1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接得到重組質(zhì)粒pET32a－SmPR10－1，然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定，都有500bp左右的目的條帶（圖4），陽性克隆測序結(jié)果顯示與目的基因SmPR10－1序列一致，未發(fā)生移碼突變，表明已成功將SmPR10－1基因克隆到原核表達(dá)載體pET－32a上。

2.3 SmPR10－1蛋白的原核表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 IPTG濃度對(duì)SmPR10－1表達(dá)的影響 保持誘導(dǎo)時(shí)間8h、誘導(dǎo)溫度30℃及起始A600為0.6不變，在0.1、0.4、0.8、1.0mmol／L這4個(gè)IPTG濃度下，觀察發(fā)現(xiàn)IPTG濃度在0.1～1.0mmol／L對(duì)SmPR10－1表達(dá)量影響不明顯（圖5）。

圖2 SmPR10－1蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測A.二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Prediction of SmPR10－1protein structure A.Secondary structure prediction；B.Prediction of three－dimensional structure

圖3 SmPR10－1蛋白與其他物種PR10蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of SmPR10－1protein and PR10proteins from other species

圖4 原核表達(dá)載體pET32a－SmPR10－1鑒定M.DL10000；1.EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pET32a－SmPR10－1載體；2.陽性克隆的PCR產(chǎn)物Fig.4 The identification of prokaryotic expression vector pET32a－SmPR10－1 M.DL10000；1.pET32a－SmPR10－1digested by EcoRⅠand XhoⅠ；2.PCR product of positive clone

2.3.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)SmPR10－1表達(dá)的影響 保持誘導(dǎo)時(shí)間8h、IPTG濃度0.4mmol／L及起始A600為0.6不變，不同誘導(dǎo)溫度（15℃、20℃、25℃、30℃、37℃）下，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)SmPR10－1表達(dá)影響明顯，20～30℃誘導(dǎo)均有利于可溶性蛋白的表達(dá)，而15℃和37℃時(shí)蛋白表達(dá)量減少（圖6）。

2.3.3 A600對(duì)SmPR10－1表達(dá)的影響 保持誘導(dǎo)時(shí)間8h、誘導(dǎo)溫度30℃及IPTG濃度0.4mmol／L不變，觀察到在不同起始菌密度（A600為0.4、0.6、0.8、1.0）時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)SmPR10－1表達(dá)有影響，發(fā)現(xiàn)起始宿主菌密度（A600＝0.8）時(shí)，SmPR10－1表達(dá)量最高（圖7）。

2.3.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)SmPR10－1表達(dá)的影響 保持誘導(dǎo)溫度30℃、IPTG濃度0.4mmol／L及起始A6000.8不變，研究誘導(dǎo)時(shí)間（4、6、8、20h）對(duì)SmPR10－1表達(dá)的影響，觀察到誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量有明顯影響，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，蛋白表達(dá)量有隨之增加的趨勢（圖8）。

圖5 不同IPTG濃度對(duì)SmPR10－1蛋白表達(dá)的影響M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；C1～C4.含pET32a空載體的E.coli菌株；1～4.分別在0.1、0.4、0.8、1.0mmol／L IPTG濃度誘導(dǎo)的含pET32a－SmPR10－1質(zhì)粒的E.coli菌株。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.5 Effect of different IPTG concentrations on the expression of SmPR10－1protein M.Protein marker；C1－C4.E.coli containing pET32aused as contro；1－4.E.coli contains pET32a－SmPR10－1induced with 0.1，0.4，0.8and 1.0mmol／L IPTG，respectively.The arrows show the recombinant SmPR10－1protein

圖6 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)SmPR10－1蛋白表達(dá)的影響M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；C.含pET32a空載體的E.coli菌株；1～5.分別在15℃，20℃，25℃，30℃，37℃誘導(dǎo)的含pET32a－SmPR10－1質(zhì)粒的E.coli菌株。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.6 Effect of different temperature on the expression of SmPR10－1protein M.Protein marker；C.E.coli containing pET32aused as contro；1－4.E.coli contains pET32a－SmPR10－1induced at 15℃，20℃，25℃，30℃，37℃，respectively.The arrows show the recombinant SmPR10－1protein

圖7 不同起始宿主菌密度（A600）對(duì)SmPR10－1蛋白表達(dá)的影響M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；C1～C4：含pET32a空載體的E.coli菌株；1～4.分別在A600為0.4、0.6、0.8、1.0條件下誘導(dǎo)的含pET32a－SmPR10－1質(zhì)粒的E.coli菌株。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.7 Effect of different initial density of host bacterium（A600）on the expression of SmPR10－1protein M.Protein marker；C1－C4.E.coli contains pET32aused as contro；1－4.E.coli containg pET32a－SmPR10－1induced at 0.4，0.6，0.8and 1.0A600，respectively.The arrowsshow the recombinant SmPR10－1protein

圖8 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)SmPR10－1蛋白表達(dá)的影響M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；C1～C4.含pET32a空載體的E.coli菌株；1～4.分別誘導(dǎo)4、6、8、20h的含pET32a－SmPR10－1質(zhì)粒的E.coli菌株。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.8 Effect of different inducing time on the expression of SmPR10－1protein M.Protein marker；C1－C4.E.coli contains pET32aused as control；1－4.E.coli containg pET32a－SmPR10－1 induced with 4，6，8，20h，respectively.The arrows show the recombinant SmPR10－1protein

2.4 重組SmPR10－1蛋白的純化

根據(jù)優(yōu)化的條件，IPTG濃度0.4mmol／L、起始A600為0.8、誘導(dǎo)溫度30℃、誘導(dǎo)時(shí)間8h，將重組SmPR10－1蛋白在大腸桿菌中大量表達(dá)，收集大腸桿菌菌體，超聲破碎，破碎液經(jīng)過離心取上清液，采用Ni2＋親和層析方法，利用Ni Sepharose 6Fast Flow Purification System（GE Healthcare）樹脂進(jìn)行純化，得到目的蛋白SmPR10－1（圖9），Bradford法測得純化蛋白濃度為1.02mg·mL－1。

圖9 重組SmPR10－1蛋白的純化M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.含pET32a空載體的E.coli菌株作為對(duì)照；2.優(yōu)化條件下誘導(dǎo)的含pET32a－SmPR10－1質(zhì)粒的E.coli菌株；3、4.純化后的重組SmPR10－1蛋白（3∶2μg上樣；4∶5μg上樣）。箭頭顯示為重組SmPR10－1蛋白Fig.9 Purification of recombinant SmPR10－1protein M.Protein marker；1.E.coli containing pET32aused as control；2.E.coli contains pET32a－SmPR10－1induced under optimized conditions；3，4.The purified recombinant SmPR10－1protein（3∶2μg；4∶5μg）.The arrows show the recombinant SmPR10－1protein

3 討 論

丹參為多年生草本植物，以根入藥，在人工栽培條件下，易受到各種病蟲害的危害，若長期大量使用農(nóng)藥，一方面易使病蟲害產(chǎn)生抗藥性，另一方面農(nóng)藥殘留會(huì)降低丹參的藥用品質(zhì)，影響丹參臨床藥效。因此從丹參自身挖掘抗性相關(guān)基因，培育抗病品種，才是緩解丹參病蟲害的根本途徑。本研究從丹參中克隆得到病程相關(guān)蛋白10基因SmPR10－1，對(duì)其核酸及其推測的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，SmPR10－1基因編碼蛋白的N端有典型的富含甘氨酸的P－loop基序（G－X－G－G－X－G），C端有（K－A－X－E－X－Y）的保守序列，說明SmPR10－1蛋白是PR10蛋白家族中的成員（Van Loon［2］、Fernandes［15］）。SmPR10－1蛋白不含信號(hào)肽，作為細(xì)胞質(zhì)蛋白發(fā)揮作用，這與其他PR家族蛋白不同，其它PR家族蛋白大多是位于胞外，具有信號(hào)肽序列，先是作為蛋白前體合成，然后在分泌過程中形成成熟蛋白［16］。

大腸桿菌是常用的外源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)之一，影響外源蛋白可溶性表達(dá)的因素有多方面，要增加可溶性蛋白的表達(dá)量，除了合理的選擇酶切位點(diǎn)、表達(dá)載體、宿主菌、試劑外，還可以通過改變培養(yǎng)條件來提高外源蛋白的可溶性表達(dá)量，如改變IPTG濃度［17］、誘導(dǎo)溫度［18］、誘導(dǎo)時(shí)宿主菌的密度（A600）［19］和誘導(dǎo)時(shí)間［18］等。本研究將目的基因SmPR10－1構(gòu)建到表達(dá)載體pET32a上，形成重組質(zhì)粒pET32a－SmPR10－1，然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），進(jìn)行蛋白表達(dá)。pET32a載體是帶有N－端硫氧還蛋白（Trx·Tag）編碼序列的融合表達(dá)載體，當(dāng)外源重組蛋白在E.coli中以不溶形式存在時(shí)，和Trx· Tag序列融合后，可增加重組蛋白的溶解性［20］；此外，表達(dá)宿主菌BL21（DE3）可以增加存在于細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的二硫鍵的形成，使得蛋白的可溶性更好，同時(shí)，利用pET32a載體表達(dá)的重組蛋白N端帶有6個(gè)His Tag標(biāo)簽，方便后續(xù)重組蛋白的純化［18］。

IPTG濃度、溫度、起始菌密度（A600）和誘導(dǎo)時(shí)間是影響原核表達(dá)的主要因素，本研究發(fā)現(xiàn)，IPTG濃度在0.1～1.0mmol／L對(duì)SmPR10－1蛋白表達(dá)量影響不明顯，最終選擇IPTG濃度為0.4mmol／L。溫度對(duì)SmPR10－1表達(dá)量有明顯影響，從15～37℃均能得到重組蛋白，但是15℃時(shí)溫度過低，不利于蛋白表達(dá)，在30℃時(shí)表達(dá)量最高，雖然在37℃時(shí)也有蛋白表達(dá)，但是和30℃條件下相比，表達(dá)量卻有所降低，這可能是37℃條件下大腸桿菌細(xì)胞各種代謝旺盛，生長加快，影響外源重組蛋白的表達(dá)，而且有可能使重組蛋白積累形成包涵體，而在25～30℃培養(yǎng)會(huì)形成可溶的、有活性的重組蛋白，最終選擇誘導(dǎo)溫度為30℃［21］。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，SmPR10－1的表達(dá)量也隨之增加，4h時(shí)表達(dá)量最低，8h與24h時(shí)表達(dá)量較高，但是誘導(dǎo)時(shí)間過長，重組蛋白的可溶性降低，可能形成包涵體，最終選擇8h作為最終誘導(dǎo)時(shí)間［22］。

本研究用分子克隆方法得到丹參SmPR10－1基因，通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中得到成功表達(dá)，在優(yōu)化表達(dá)體系為IPTG濃度0.4mmol／L、起始宿主菌密度A600為0.8、誘導(dǎo)溫度30℃、誘導(dǎo)時(shí)間8h的條件下，SmPR10－1在大腸桿菌中能夠得到很好的表達(dá)，采用Ni2＋親和層析得到了純化的目的蛋白，為進(jìn)一步研究SmPR10－1蛋白的生物學(xué)活性，抗體制備和SmPR10－1基因在丹參抗病方面的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯：宋亞珍）

Cloning and Expression Analysis of Pathogenesis－related Protein 10Gene of Salvia miltiorrhiza

ZHAO Le1，MA Ligang1，WANG Zhishuang2，SHEN Ye2，ZHENG Xiaoke1
（1School of Pharmacy，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China；2National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

The synthesis of pathogenesis－related proteins（PR）is one prominent feature of plant defense responses on abiotic or non－abiotic stress situations.According to the transcriptome data of Salvia miltiorrhiza，designing specific primers and using reverse transcription－polymerase chain reaction（RT－PCR），we isolated an open reading frame of pathogenesis－related protein 10（PR10）fromS.miltiorrhizaand named as SmPR10－1（GenBank Accession No.KF877034）.The results indicated that：（1）SmPR10－1has an open reading frame（ORF）of 477bp，which encoded a protein of 158amino acid residues，with a predicted molecular mass of 17.38kD.（2）Bioinformatic analysis indicated that SmPR10－1protein showed the highest homology，69%identity，with PR10protein fromVitis vinifera with the same conserved sequence（G－X－GG－X－G）and（K－A－X－E－X－Y）.（3）Escherichia coli BL21cells were transformed with the expression vector pET32a－SmPR10－1and used for prokaryotic expression.Meanwhile，the four factors，inducing IPTG concentrations，initial density of host bacterium（A600），inducing temperature and inducing time，which influenced protein expression，were optimized.The optimum expression conditions of SmPR10－1were final IPTG concentration of 0.4mmol／L，A600of 0.8，and the inducing time of 8hat 30℃.Finally，the recombi－nant SmPR10－1protein was purified through Ni2＋affinity chromatography.The results of this study provided not only the first and fundamental information about SmPR10－1gene，but also a candidate gene for future genetic engineering of Chinese medical herbs，S.miltiorrhiza，against pathogen attack.

Salvia miltiorrhiza；pathogenesis－related protein；bioinformatic analysis；prokaryotic expression；optimization of expression condition

Q785；Q786

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1078

1000－4025（2015）06－1078－07

2015－02－03；修改稿收到日期：2015－04－17

國家自然科學(xué)基金（81173490，8130070）；河南中醫(yī)學(xué)院博士科研基金（BSJJ2011－07）

趙 樂（1983－），男，博士，講師，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究。E－mail：zhaole1983＠126.com