付文婷，何建文，楊 紅，邢 丹，張愛民，蘇 丹，韓世玉

（貴州省辣椒研究所，貴州 貴陽550006）

在辣椒單倍體育種中，通過辣椒花藥培養(yǎng)出的再生植株，往往是染色體倍性水平不同的混合群體[1－3]，早期的倍性鑒定是構(gòu)建DH 群體十分重要的技術(shù)環(huán)節(jié)[4]，所以有效的倍性鑒定關(guān)系到單倍體的育種進(jìn)程，也是了解其遺傳背景和進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的倍性鑒定方法有染色體壓片計(jì)數(shù)法[5]、觀察開花結(jié)實(shí)情況[6]和葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的大小及其葉綠體數(shù)目的測定進(jìn)行倍性判斷[7－9]，前者程序復(fù)雜耗時(shí)多，但準(zhǔn)確性高；中間者的鑒定時(shí)期太晚，導(dǎo)致單倍體材料無法收種，浪費(fèi)育種材料；后兩者易受操作者的經(jīng)驗(yàn)影響，導(dǎo)致鑒定結(jié)果不同[10]。DNA流式細(xì)胞儀測定法通過測量核DNA 含量進(jìn)行倍性鑒定，該方法具有快速、準(zhǔn)確和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，但檢測費(fèi)用大，只適宜于小批量的植株倍性檢測[11－12]。不同的倍性鑒定方法會導(dǎo)致不同的鑒定結(jié)果。所以尋求一種準(zhǔn)確、快捷且有效的方法非常必要，對加速辣椒育種進(jìn)程也具有重要意義。筆者以自育辣椒為試材，以DNA 流式細(xì)胞測定結(jié)果為依據(jù)，研究染色體壓片技術(shù)法結(jié)合后期再生植株生長狀況及坐果調(diào)查對染色體的倍性構(gòu)成進(jìn)行分析，并結(jié)合3種方法對倍性準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，從而篩選有價(jià)值的材料，對辣椒單倍體育種技術(shù)在實(shí)踐中的利用具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)苯?/h3>

供試材料為8024，在貴州省辣椒研究所試驗(yàn)基地種植。自2012年4月下旬開始，取辣椒材料8024花蕾進(jìn)行花藥培養(yǎng)，采用MS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[13]。獲得花藥培養(yǎng)再生植株15 株。再生植株均為2012年5—9月于貴州省辣椒研究所綜合實(shí)驗(yàn)室通過花藥培養(yǎng)獲得。選用8024正常二倍體作為對照材料。

1.2 根尖染色體壓片計(jì)數(shù)法

分別取8024正常組培苗和8024花藥培養(yǎng)再生植株0.5～1cm 長的根尖，先經(jīng)過秋水仙素預(yù)處理3h，再經(jīng)卡諾固定液固定24h 后，用清水沖洗3次，再用1mol／L HCl在60℃水浴條件下解離3～5min，最后用卡寶品紅染色制作壓片，在10×40倍顯微鏡（Olympus X71）下觀察根尖染色體并計(jì)數(shù)，拍照成像。

1.3 DNA流式細(xì)胞儀倍性鑒定法

分別取大小1cm 左右的幼苗葉片作為倍性檢測材料。采用BC公司的Cyflow space流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定。使用Mod Fit軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1）測定步驟。取對照和花培再生植株新鮮葉片大小約1g，分別加入400μL細(xì)胞裂解液中，用手術(shù)刀片切碎、過濾、收集濾液，經(jīng)800r／min 離心5 min后，用DAPI染液對細(xì)胞核DNA 進(jìn)行熒光標(biāo)記，置于暗處30min后，用流體細(xì)胞儀進(jìn)行植株倍性鑒定。上樣后流式細(xì)胞儀自動形成代表該樣品倍性的DNA 含量分布圖。

2）倍性鑒定。用已知二倍體8024作對照調(diào)試流式細(xì)胞儀，使對照的G1 期位于200 道附近（圖1）。每個(gè)待測樣本測定1次，G1期的DNA 峰值處于100道、200道、300道和400道附近的分別為單倍體、二倍體、三倍體和四倍體，其余的為非整倍體。

1.4 花培再生植株的形態(tài)及坐果情況調(diào)查

2012年12月—2013年4月，陸續(xù)將15株花培再生植株移栽到花盆中放入塑料大棚，進(jìn)行田間正常管理。2013年9—11月期間對單株進(jìn)行采收，記錄正常坐果數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA流式細(xì)胞儀檢測再生植株的倍性構(gòu)成

用DNA流式細(xì)胞儀檢測的辣椒花藥培養(yǎng)15株再生單株中，結(jié)果顯示單倍體、二倍體、混倍體（同一片葉是由單倍體、二倍體倍性的細(xì)胞組成）和非整倍體同時(shí)存在（圖1）。單倍體為10 株，二倍體3株，混倍體和非整倍體各1株，各占再生植株總數(shù)的66.7%、20%、6.65%和6.65%。倍性在鑒定過程中，DNA 含量分布圖有時(shí)會有偏鋒的問題，如G1和G2的峰在200，400道偏右的位置，通過重復(fù)檢測，這種現(xiàn)象會消失，這是因?yàn)闃颖緶?zhǔn)備時(shí)間太長所致[14]。但通過根尖染色體數(shù)顯示染色體數(shù)為24條，而且坐果也正常，所以此植株為二倍體。

2.2 根尖染色體壓片計(jì)數(shù)法鑒定倍性構(gòu)成

根尖壓片染色體計(jì)數(shù)法觀察到這15株花藥培養(yǎng)再生植株中，單倍體、二倍體和混倍體各為10株、4株和1株，各占再生植株總數(shù)的66.7%、26.7%和6.6%。其中，混倍體的情況是同一植株同一根的細(xì)胞為單倍體、二倍體2種倍性構(gòu)成（圖2）。

2.3 DNA流式細(xì)胞儀與染色體壓片計(jì)數(shù)法測定再生植株倍性的差異

從表得出，在15 株單株的測定中，2 種檢測方法10株單倍體，3株二倍體，1株混倍體，共14株得到一致的結(jié)果。剩余1株，流式細(xì)胞儀測定為非整倍體，而染色體壓片測定為二倍體。2種方法吻合度為93%。

圖1 流式細(xì)胞儀測定的辣椒花藥培養(yǎng)再生植株DNA分布Fig.1 DNA distribution in anther culture derived pepper plants in FCM analysis

圖2 單倍體（n＝12）、二倍體（n＝24）和混倍體細(xì)胞的染色體Fig.2 Chromosome of haploid cell（n＝12），diploid cell（n＝24）and mixoploid cell

2.4 再生植株移栽后的生長與坐果情況

將15株花藥培養(yǎng)再生植株移栽到花盆中，由于再生植株的生長勢很弱，除了1株非整倍體在移栽后死亡，其余14株都能正常生長，植株移栽后的生長情況與DNA 細(xì)胞流式儀檢查結(jié)果相一致。

2.4.1 不同倍性再生植株移栽后成株期的田間表現(xiàn) 再生植株移栽后，不同倍性的植株表現(xiàn)差別比較大。單倍體植株矮小，葉片小，但分枝能力很強(qiáng)，達(dá)12～18枝／株，遠(yuǎn)大于二倍體（5～8 枝／株）。二倍體與其他正常二倍體植株并無差別?；毂扼w表現(xiàn)與二倍體植株大小也無區(qū)別，只是葉片稍大于二倍體，葉色較深。

2.4.2 不同倍性植株花期田間表現(xiàn) 單倍體再生植株花蕾大部分黃化，很容易落花，正常開放的花明顯小于二倍體，花瓣黃白，花瓣開展度與花柱呈45°，花藥遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于柱頭，花藥干癟且無花粉，但隨著花期的延長，開到第四層花時(shí)，花藥有少量花粉且有活力；二倍體植株開花習(xí)性、花形態(tài)特征均與自然生長的二倍體植株無區(qū)別，花瓣為白色，花瓣開展度與花柱呈90°；混倍體植株表現(xiàn)為花瓣白色，花藥部分可育，部分不可育（圖3）。

圖3 不同倍性植株移栽后的花器官Fig.3 Floral organ of plants with different ploidy after transplantation

2.4.3 再生植株倍性與再生植株坐果情況的相關(guān)性 由表可見，被檢測的15 株再生植株中，除了1株非整倍體在移栽后死亡，成活的14株再生植株中3株二倍體正常結(jié)實(shí)外，其余的10株單倍體中有8株沒有正常的果實(shí)和種子，其余2株結(jié)正常果實(shí)，但果實(shí)比正常二倍體果實(shí)小，部分果實(shí)結(jié)籽，另一部分結(jié)假性果實(shí)，說明單倍體也有一定的育性[15]。另外1株混倍體（單倍體＋二倍體）有正常的果實(shí)和種子。說明，DNA 流式細(xì)胞儀和染色體計(jì)數(shù)的倍性檢測結(jié)果與坐果情況一致。

表 花藥培養(yǎng)再生植株倍性與再生植株的坐果情況Table Ploidy level and fructification in regenerated plants

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)中辣椒花藥培養(yǎng)再生植株群體中除了單倍體和二倍體外，尚未發(fā)現(xiàn)三倍體和四倍體，可能是檢測再生群體數(shù)量比較少，這與張麗等研究一致[16]；但試驗(yàn)中也出現(xiàn)混倍體和非整倍體的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是植株不同器官的染色體數(shù)目構(gòu)成不一致所致，還是這15株花藥再生植株的染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變異導(dǎo)致DNA 甲基化[17]，尚有待進(jìn)一步研究。研究表明：染色體壓片計(jì)數(shù)法和DNA 流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果基本一致。采用染色體壓片計(jì)數(shù)法在群體不大的情況下還是一種準(zhǔn)確可行的方法，能準(zhǔn)確反映出染色體數(shù)目。此方法雖然簡單易行，但需要熟練的細(xì)胞學(xué)操作技術(shù)，材料處理繁瑣耗時(shí)[18]。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，由于花藥培養(yǎng)再生植株不同器官和組織可能存在混倍性的現(xiàn)象，導(dǎo)致結(jié)果不一，所以不能僅憑個(gè)別的染色體數(shù)目來決定植株的倍性，需要大量壓片結(jié)果才能準(zhǔn)確的反映出植株倍性情況。

采用細(xì)胞流式儀可以對大量的花藥培養(yǎng)再生植株進(jìn)行倍性鑒定，鑒定結(jié)果快速準(zhǔn)確[19]，但其樣品準(zhǔn)備時(shí)間不宜過長，否則會影響鑒定結(jié)果[14]。對于不同的作物、不同的取材部位，所用的裂解液配方、操作程序、儀器工作參數(shù)都有變化，所以通過試驗(yàn)找出針對某種作物某一取材部位的最佳流式細(xì)胞儀工作條件，建立DNA 流式細(xì)胞儀分析體系是今后使用流式細(xì)胞儀檢測倍性的工作方向。田間再生植株生長和坐果情況也不能真實(shí)反映再生植株的倍性情況，尤其單倍體植株部分雖然結(jié)果，但果實(shí)沒有結(jié)籽（假性果實(shí)），與熊秋芳等研究結(jié)果一致[20]，所以在試驗(yàn)條件允許的情況下，可以用染色體壓片計(jì)數(shù)法結(jié)合流式細(xì)胞儀鑒定法，后期觀察再生植株結(jié)籽情況會更加準(zhǔn)確的反映鑒定結(jié)果，能更好的將單倍體培養(yǎng)應(yīng)用到育種實(shí)踐中去。

[1]周偉軍，毛碧增，唐桂香，等.甘藍(lán)型油菜小孢子再生植株染色體倍數(shù)檢測研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（6）：724－727.

[2]申書興，趙前程，劉世雄，等.四倍體大白菜小孢子植株的獲得與倍性鑒定[J].園藝學(xué)報(bào)，1999，26（4）：232－237.

[3]周元昌，KENNEDYS.抱子甘藍(lán)花培苗倍性的快速鑒定[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，31（1）：55－58.

[4]介智靖，閆曉紅，方小平，等.甘藍(lán)型油菜DH 植株創(chuàng)建及其倍性的流式鑒定[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2010，32（3）：349－353.

[5]Ockendon J.The ploidy of plants obtaind from anther culture of cauliflowers（Brassica olevacea var.botrytis）[J].Annals of Applied Biology，1998，113：319－325.

[6]陳 斌，耿三省，張曉芬，等.辣椒花藥培養(yǎng)再生植株染色體倍數(shù)檢測研究[J].辣椒雜志，2005（4）：28－30.

[7]張菊平，鞏振輝，劉珂珂，等.辣椒染色體倍性水平的快速檢測[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，8（35）：121－124.

[8]張曉芬，耿三省，陳 斌.辣椒染色體倍性與氣孔性狀的相關(guān)性[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（2）：339－342.

[9]鄧耀華，熊 藝，周國林，等.甘藍(lán)小孢子植株倍性簡易鑒定方法研究[J].中國蔬菜，2009（18）：46－50.

[10]付文婷.大白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)及植株再生技術(shù)研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[11]田曉娥，朱友銀，趙德剛.貴州10種玉米基因型組織培養(yǎng)再生體系的建立[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2012，31（3）：194－199.

[12]成 妍，班青宇，王 倩，等.不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)及再生植株的倍性鑒定[J].2009，32（2）：25－29.

[13]付文婷，韓世玉，邢 丹，等.不同培養(yǎng)基及采花期對辣椒花藥培養(yǎng)的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（10）：83－86.

[14]Farnham M W，Caniglia E J，Thomas C E.Efficient ploidy determination of anther deriver broccoli[J].Hortscience，1998，32（2）：323－327.

[15]張正海，毛勝利，王立浩，等.辣椒單倍體離體誘導(dǎo)及育種應(yīng)用[J].園藝學(xué)報(bào)，2012，39（9）：1715－1726.

[16]張 麗，趙秋菊，付傳翠，等.蘿卜花藥培養(yǎng)技術(shù)研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（5）：55－58.

[17]姚 軍，武 劍，王曉武，等.小白菜小孢子培養(yǎng)再生植株的倍性與基因組DNA 甲基化的關(guān)系[J].中國蔬菜，2009（14）：12－16.

[18]李懋學(xué)，張教方.植物染色體研究技術(shù)[M].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，1991.

[19]Arumuganthan K，Earle E D.Estimation of nuclear DNA content of plants by flow cytometry[J].Plant Mo1.Bio1.Report，1991，9：229－241.

[20]熊秋芳，張雪清，榮凱峰.蘿卜花藥培養(yǎng)再生植株染色體倍數(shù)FCM 分析及田間觀察[J].中國蔬菜，2007（12）：19－21.