楊利勇，李春鳳，周繼勇

（1.浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310058；2.貴州福斯特生物科技有限公司，貴州 貴陽(yáng)550014）

豬圓環(huán)病毒（Porcine cirvovirus，PCV）屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，被國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）第6次學(xué)術(shù)報(bào)告列為一個(gè)新的病毒。PCV 最早在PK－15 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，開(kāi)始認(rèn)為是一種細(xì)胞污染物[1－2]。PCV分為2個(gè)主要的基因型，即PCV1 與PCV2型，其中PCV2被認(rèn)定是導(dǎo)致仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭征（PMWS）的主要病原[3]。PCV2常與細(xì)小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬肺炎支原體 （MPS）、偽狂犬病毒（PRV）混合感染，造成豬的免疫失敗[4－5]。PCV2基因組有11個(gè)開(kāi)放性閱讀框，其中ORF1是PCV2基因組中最大的閱讀框，編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep）[6]，Rep蛋白能被原核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)[7]，為在蛋白水平上研究Rep 蛋白提供了良好的工具。將體外表達(dá)的ORF1編碼蛋白與表達(dá)粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子的真核表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合免疫豬群，能起到抵抗PCV2攻擊的作用，表明針對(duì)ORF1基因編碼蛋白的抗體可能具有中和病毒的作用[8]。鑒于此，筆者針對(duì)PCV2ORF1基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，以PCV2陽(yáng)性病料所提DNA 為目標(biāo)，獲取PCV2貴州株（PCV2－GZ）ORF1基因，并分析其生物信息學(xué)特性，旨在為后續(xù)的疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料及試劑

PCV2貴州株（PCV2－GZ）陽(yáng)性病料，由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所保存。DNAiso Reagent提取試劑盒，pMD18－T 載體，dNTPs，200bp DNA Marker，Amp，購(gòu)自大連寶生物有限公司；Gel Extraction Kit（50×）膠回收試劑，E.Z.N.ATMPlasmid Mini Kit質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；Taq酶，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶（BamH Ⅰ、HindⅢ），購(gòu)自MBI公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank 登錄PCV2 代表性毒株ORF1基因序列，以Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)ORF1基因的 特 異 性 引 物， P－F： 5′－ATGCCCAGCAAGAAGAATG－3′， P－R：5′－TCAGTAATTTATTTCATATGGAA－3′，大小945bp，由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.3 目的基因的獲取、克隆及序列測(cè)定

PCV2－GZ陽(yáng)性病料無(wú)菌研磨處理后，按DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取病料總DNA，以總DNA 為模板，用引物P－F／P－R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：引物（10pmoL／μL）各2μL，10×PCR Buffer（含MgCl2）5μL，dNTP（10 mmol／L）1 μL，Taq 酶（5U／μL）1μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足50.0μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以膠回收試劑盒純化回收目的基因。按常規(guī)T 載體克隆方法進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建及PCR；將擴(kuò)增片段克隆到pMD18－T中，所得重組質(zhì)粒以EcoRⅠ／HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定；將初步鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.4 PCV2ORF1 生物信息學(xué)分析

用DNAStar軟件對(duì)PCV2－GZ 與國(guó)內(nèi)外毒株（表）進(jìn)行ORF1 基因核苷酸、氨基酸同源性分析，并分別分析其編碼蛋白的α－螺旋、β－折疊、T－轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲及親水性、表面可及性和抗原指數(shù)，對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和B 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，用Karplus－Schulz方法預(yù)測(cè)其柔性區(qū)域；用MegAlign軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，比較分離株親緣關(guān)系；用InterProScan軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)域；用SWISS－Model軟件預(yù)測(cè)蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)。

表 PCV2 ORF1核苷酸序列的登錄信息Table The genbank accession information of different PCV2strains

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增

從 圖1 可 知，PCV2－GZ 陽(yáng) 性 病 料 經(jīng)PCV2ORF1特異性引物擴(kuò)增出945bp的特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。

圖1 PCV2 ORF1基因的PCR 擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1 PCR results of ORF1PCV2

2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定

經(jīng)雙酶切鑒定，電泳檢測(cè)到961bp和2 692bp的2條譜帶（圖2），酶切結(jié)果與預(yù)期相符，初步證明所克隆的目的基因成功插入pMD18－T 載體，可進(jìn)行后續(xù)基因序列測(cè)定。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果Fig.2 The double digestion of restructuring plasmid

2.3 PCV2－GZ ORF1基因序列

經(jīng)測(cè)序，PCV2－GZORF1基因全長(zhǎng)945bp，編碼Rep蛋白共314個(gè)氨基酸（圖3）。測(cè)序結(jié)果登陸GeneBank，獲取登錄號(hào)為KF152883。

2.4 ORF1基因的同源性

經(jīng)同源性分析，PCV2－GZORF1基因與其他14株毒株的核苷酸同源性為96.8%～99.7%，與國(guó)內(nèi)HUB－5和ZJ－38的同源性最高，均為99.7%。推導(dǎo)的氨基酸序列同源性，PCV2－GZ編碼的Rep蛋白與韓國(guó)P710－1和國(guó)內(nèi)HUB－5、SC－10、ZJ－38株的較高，均為99.4%。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

從圖4可知，PCV2－GZORF1基因與國(guó)內(nèi)毒株相應(yīng)序列同屬于一個(gè)分支，而與國(guó)外毒株（韓國(guó)P710－1株）的親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn)。

圖3 PCV2－GZORF1 基因的序列Fig.3 The sequeces of the PCV2－GZ ORF1gene strain

圖4 PCV2 ORF1基因的核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of ORF1gene nucleotide

圖5 PCV2－GZ Rep蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure prediction of PCV2－GZ Rep protein

2.6 Rep蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原表位

經(jīng)預(yù)測(cè)，Rep蛋白柔性區(qū)域呈散在性分布，以β－折疊、T－轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲為主（圖5）?？赡艿目乖?位區(qū)為N 端第2～18 位、23～34 位、86～98位、159～167位、189～205位、287～297位（圖6），推測(cè)PCV2－GZ Rep蛋白可形成優(yōu)勢(shì)抗原表位。

圖6 PCV2－GZ Rep蛋白的抗原表位Fig.6 Epitope prediction of PCV2－GZ Rep protein

圖7 PCV2－GZ ORF1基因Rep蛋白的結(jié)構(gòu)域Fig.7 The Rep protein domain of ORF1gene of PCV2isolation GZ

圖8 PCV2－GZ ORF1基因Rep蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.8 The Rep protein domain of ORF1gene of PCV2isolation GZ

2.7 蛋白結(jié)構(gòu)域及蛋白三維結(jié)構(gòu)

從圖7 可知，PCV2－GZ Rep 蛋白第171～257位氨基酸處存在解旋酶；在N 端15～100位氨基酸處存在病毒復(fù)制相關(guān)蛋白；在111～285位氨基酸處存在P－loop，是dNTP 結(jié)合的位點(diǎn)，具有潛在的ATP水解酶功能，且不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。

經(jīng)預(yù)測(cè)，PCV2－GZORF1基因Rep蛋白含有β－折疊和T－轉(zhuǎn)角（圖8）。

3 結(jié)論與討論

Rep蛋白由PCV 最大的開(kāi)放閱讀框ORF1編碼，ORF1 基因由病毒的正向鏈轉(zhuǎn)錄而成，與PCV基因組滾環(huán)復(fù)制相關(guān)[9]。Rep蛋白和Rep’蛋白是PCV 病毒復(fù)制所必需。PCV1Rep基因的啟動(dòng)子位于728～838位核苷酸區(qū)域[10]。Rep 蛋白具有與典型滾環(huán)復(fù)制（RCR）相關(guān)的3個(gè)保守結(jié)構(gòu)，分別為Ⅰ（FTLNN）、Ⅱ（HLQG）、Ⅲ（YCSK）以及結(jié)合dNTPs的P環(huán)（P－loop）結(jié)構(gòu)（序列為G－GKS），對(duì)維持Rep蛋白的功能至關(guān)重要，缺失或突變均會(huì)影響病毒的復(fù)制[11]。PCV2Rep基因位于第51～995位核苷酸，含有945個(gè)堿基，編碼315個(gè)氨基酸，編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白。PCV1與PCV2相比，氨基酸序列同源性達(dá)86%，但Rep 蛋白相對(duì)比較保守，2種血清型PCV 病毒有抗原交叉。曾朔等[12]研究表明，圓環(huán)病毒Rep基因可能是原核生物解旋酶編碼基因間的重組產(chǎn)物。

研究結(jié)果表明，PCV2－GZORF1 基因全長(zhǎng)為945bp，編碼314個(gè)氨基酸，與國(guó)內(nèi)外流行毒株的同源性（98.1%～99.4%）較高。核苷酸序列與國(guó)內(nèi)毒株的同源性較高，可能是由于近年來(lái)貴州畜牧業(yè)的快速發(fā)展，大量跨區(qū)引種，豬群流動(dòng)性增加所致[13]。Rep蛋白是PCV 病毒在復(fù)制早期利用宿主細(xì)胞的蛋白合成系統(tǒng)，由自身基因組上的ORF1 轉(zhuǎn)錄、翻譯及加工而成，主要功能是在截短蛋白R(shí)ep’的協(xié)同作用下，啟動(dòng)和終止病毒DNA 滾環(huán)式復(fù)制[14]。Rep蛋白不存在于病毒粒子中，在體外培養(yǎng)細(xì)胞（如PK－15）中含量也較少，要獲取足量的一定純度的天然Rep蛋白變得極為困難，一般采用體外表達(dá)來(lái)獲取該蛋白[15]。利用軟件對(duì)PCV2－GZORF1 基 因Rep蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，Rep蛋白可形成優(yōu)勢(shì)抗原表位，且不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，推測(cè)可進(jìn)行PCV2ORF1基因的全基因表達(dá)[16]。

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