葛 飛，石貝杰，高櫻萍，胡夢(mèng)君，龔 倩，桂 琳

（1 安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2 皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，安徽蕪湖241000）

植物內(nèi)生真菌是生活在健康的植物組織內(nèi)部，形成不明顯侵染的一類真菌［1］。因其能產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的生理活性成分，從植物內(nèi)生菌中尋找新型的天然產(chǎn)物和活性物質(zhì)是目前一個(gè)重要的研究方向，受到了越來越廣泛的關(guān)注［2－4］。植物內(nèi)生真菌分布非常廣泛，能產(chǎn)生多種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性［5］，被認(rèn)為是尋找新的生物活性物質(zhì)的重要資源［6］。銀杏含有多種功效成分［7］，是中國(guó)特有的珍稀植物。根據(jù)內(nèi)共生的理論，銀杏內(nèi)生真菌有可能產(chǎn)生與銀杏組織相同功效的活性成分，加強(qiáng)對(duì)其內(nèi)生真菌的研究開發(fā)具有重要意義［8］。Xiao等［9］對(duì)80種分離自銀杏的內(nèi)生真菌的抗菌活性進(jìn)行了研究，其中15株內(nèi)生菌能抑制至少一種測(cè)試菌，部分銀杏內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抑菌活性，是尋找和發(fā)現(xiàn)抗菌活性物質(zhì)的潛在資源。鞠秀云等［10］采用氣－質(zhì)聯(lián)用法對(duì)銀杏內(nèi)生菌發(fā)酵液中揮發(fā)油成分進(jìn)行了研究，分離出18個(gè)峰，被確認(rèn)為17種化合物。申屠旭萍等［11］對(duì)銀杏內(nèi)生真菌No．1028菌株代謝產(chǎn)物的抗真菌活性及其培養(yǎng)生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用。

銀杏葉是目前臨床使用較廣泛的中藥材之一，銀杏葉提取物制劑已成為全球植物藥制劑的重要品種［12］。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從銀杏葉中分離的一株內(nèi)生真菌SG0016，其發(fā)酵液甲醇提取物具有較高的DPPH 自由基清除能力。本研究采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其抗氧化培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用和天然抗氧化劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)和新途徑。

1 材料和方法

1．1 材 料

（1）菌株：內(nèi)生真菌SG0016從銀杏健康葉片中分離、純化獲得。（2）斜面培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1 000mL）。（3）種子液和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：PDB 培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL）。

1．2 儀器和試劑

1．2．1 主要儀器 QHZ－123B 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 （江蘇太倉市華美生化儀器廠）；SW－CJ－2F 型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；RE－25旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Tecan SUNRISE酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；FD－83冷凍干燥機(jī)（美國(guó)SIM 公司）；YXJ－2離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TP600 型梯度PCR 儀（日本TaKaRa公司）；DYCP－31DN 電泳儀（北京市六一儀器廠）；JS－380C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）。

1．2．2 主要試劑 DPPH 試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，葡萄糖等化學(xué)試劑均為分析純。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 銀杏內(nèi)生真菌的分離、純化方法 將采集的新鮮銀杏葉表面清洗干凈，在無菌操作臺(tái)中用95%乙醇漂洗2min，再用無菌水沖洗，然后用5．2%次氯酸鈉溶液漂洗10s，無菌水沖洗5次，使用無菌紗布將水分濾干。將銀杏葉切成0．5cm×0．5cm 小片，每個(gè)培養(yǎng)皿中植入3～4塊銀杏小葉片，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～20d。當(dāng)培養(yǎng)皿上從銀杏葉切片處向周圍長(zhǎng)出菌絲時(shí)，采取尖端菌絲挑取法，將內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)移到新PDA 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接、純化后，轉(zhuǎn)移到PDA 斜面試管中保存、備用。在整個(gè)分離過程中設(shè)置2個(gè)對(duì)照組，一是將最后一次沖洗的無菌水于平板中涂布均勻；二是將經(jīng)表面消毒的銀杏葉片放入培養(yǎng)基中，靜置20 min 后取出葉片，將這2個(gè)對(duì)照組與放置銀杏葉片的培養(yǎng)皿一起培養(yǎng)，若這2個(gè)對(duì)照培養(yǎng)皿中未長(zhǎng)出菌落則說明表面消毒徹底，進(jìn)而確定分離出的真菌為銀杏內(nèi)生真菌。

1．3．2 銀杏內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物的制備 在250mL錐形瓶中加入100mL PDB培養(yǎng)基。滅菌后，將已培養(yǎng)好的內(nèi)生真菌接種于PDB培養(yǎng)基。在25℃、170r／min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)7d，濾去菌絲體備用，濾液用95%乙醇醇沉12h后，濃縮、凍干即為供試樣品。

1．3．3 形態(tài)學(xué)觀察 在無菌操作臺(tái)中挑取少許平板培養(yǎng)的菌絲置于載玻片上，壓好蓋玻片，確定無氣泡后，于光學(xué)顯微鏡下觀察、記錄、拍照。直接用導(dǎo)電膠粘少許菌絲，置于電子顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)。

1．3．4 菌絲體DNA提取 采用苯酚氯仿法。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液倒入1．5mL 離心管中，離心取菌絲體，凍干。加入200μL 苯酚、氯仿（比例為1∶1），振蕩1min，使有機(jī)相和水相充分混合。置于12 000 r／min離心機(jī)中，室溫離心5min。將上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，0℃下用2～3倍無水乙醇沉淀。在4℃、12 000r／min條件下，離心10min，收集沉淀。將收集到的沉淀用70%乙醇洗滌，室溫12 000r／min離心2min，吸去上清液，空氣干燥，將沉淀溶于30μL無菌水中。

1．3．5 PCR擴(kuò)增 采用通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′），50μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行DNA 擴(kuò)增。50μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為模板DNA 1μL、dNTP（10mmol／L）1μL、引物各2 μL、10×Buffer 5μL、Taq酶1μL、去離子水40 μL。于94℃預(yù)變性5min后，反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性30s、55℃退火40s、72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，最終于72℃延伸5min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1．3．6 發(fā)酵液抗氧化活性的測(cè)定 用甲醇浸提SG0016菌株發(fā)酵液凍干物，將浸提液稀釋成5mg／mL。在96孔酶標(biāo)板中分別加入不同樣品的溶液100μL和0．2mg／mL的DPPH 溶液100μL，每個(gè)樣品重復(fù)3次。樣品加入后，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，參數(shù)設(shè)置為（震蕩30s，溫度37℃、波長(zhǎng)517 nm），在此條件下測(cè)定其吸光度（Ap）。以不加DPPH 的樣品空白吸光度（Ac）和加DPPH 但不加樣品（以甲醇100μL 代替樣品）的吸光度（Amax）為空白對(duì)照。自由基清除率（%）按下列公式計(jì)算：

自由基清除率（%）＝［1－（Ap－Ac）／Amax］×100%

1．3．7 SG0016菌株產(chǎn)抗氧化活性成分培養(yǎng)條件優(yōu)化 （1）較佳接種量的確定 以PDB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25℃，裝液量為100 mL（250 mL的三角瓶，下同），接種量分別為1%、3%、5%、10%和15%，培養(yǎng)時(shí)間為9d，按1．3．4所述方法測(cè)定發(fā)酵液抗氧化活性，每組處理3個(gè)平行。

（2）較佳培養(yǎng)溫度的確定 以PDB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為100 mL，接種量10%，培養(yǎng)溫度分別為20、23、25、28、30和33℃，培養(yǎng)時(shí)間為9 d，按1．3．4所述方法測(cè)定發(fā)酵液抗氧化活性，每組處理3個(gè)平行。

（3）較佳裝液量的確定 以PDB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25℃，裝液量分別為25、50、75、100和125mL，接種量10%，培養(yǎng)時(shí)間為9d，按1．3．4 所述方法測(cè)定發(fā)酵液抗氧化活性，每組處理3個(gè)平行。

（4）較佳培養(yǎng)時(shí)間的確定 將SG0016種子液按5%接種量接種于PDB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25℃，裝液量為100 mL，從發(fā)酵第3 天起，每隔24h取樣1次，按1．3．4所述方法測(cè)定發(fā)酵液抗氧化活性，直到第12天為止，每組處理3個(gè)平行。

（5）較佳碳源的確定 以蛋白胨（2%）為氮源，分別選用麥芽糖、蔗糖（分析純）、葡萄糖（分析純）、果糖、玉米淀粉、可溶性淀粉（分析純）、乳糖（分析純）、馬鈴薯作為供試碳源，含量均為3%。裝液量為100 mL，接種量10%，培養(yǎng)時(shí)間為8d，按1．3．4所述方法測(cè)定發(fā)酵液抗氧化活性，每組處理3個(gè)平行。

（6）較佳氮源的確定 以葡萄糖（3%）碳源，選擇蛋白胨、酵母浸出膏、豆渣粉、尿素、NH4Cl、硫酸銨、NH4NO3作為供試碳源，含量均為2%。裝液量為100mL，接種量10%，培養(yǎng)時(shí)間為8d，按1．3．4所述方法測(cè)定發(fā)酵液抗氧化活性，每組處理3個(gè)平行。

（7）正交試驗(yàn) 在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交表L9（34），以菌株發(fā)酵液提取物DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，以接種量（A），培養(yǎng)溫度（B），裝液量（C）和培養(yǎng)時(shí)間（D）為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。每個(gè)因素選取3個(gè)水平，每個(gè)水平進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，篩選出各因素之間的最佳組合。

2 結(jié)果與分析

2．1 SG0016菌株鑒定結(jié)果

2．1．1 SG0016菌株形態(tài)學(xué)特征 菌株SG0016在PDA 平板上生長(zhǎng)初期為白色絨毛狀，生長(zhǎng)較為緩慢（圖1，A），培養(yǎng)5d左右，白色絨毛狀菌絲上生出暗綠色孢子并逐漸連成一片，在PDA 培養(yǎng)基上呈暗綠色，背面褐色，邊緣不整齊（圖1，B）。子囊殼散生或群生，卵形或近球形，表生（圖1，C）。子囊孢子亞球形或卵圓形（圖1，D）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Lists of factor and level indices for orthogonal analysis

2．1．2 SG0016 的分子生物學(xué)鑒定 利用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增得到大小為500～750bp的PCR產(chǎn)物（圖2），測(cè)序結(jié)果表明，目的片段長(zhǎng)度為553 bp。將測(cè)定的堿基序列與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，菌株SG0016 的rDNAITS擴(kuò)增片段的堿基序列與Chaetomiumglobosumstrain OUCMBI101038序列相似性為99%，僅有6個(gè)堿基的差異。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定菌株SG0016為球毛殼菌，將其命名為ChaetomiumglobosumSG0016。

2．2 SG0016菌株液態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化

2．2．1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響 由圖3，A 可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)酵液甲醇提取物對(duì)DPPH 自由基清除率逐漸升高。第8天時(shí)，清除率達(dá)到最高，為91．74%；培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，自由基清除率呈下降趨勢(shì)，在第12天時(shí)，自由基清除率降低到61．15%。因此，確定較佳培養(yǎng)時(shí)間為8d。

2．2．2 接種量對(duì)發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響 微生物液態(tài)發(fā)酵過程中，接種量大小影響菌體生長(zhǎng)速度和代謝產(chǎn)物的量。由圖3，B可見，接種量在1%～10%范圍內(nèi)時(shí)，隨著接種量的增加，自由基清除率逐步升高；接種量為10%時(shí)，DPPH 自由基清除率最高，為90．16%。接種量進(jìn)一步增大為15%時(shí)，發(fā)酵液的自由基清除能力反而降低到88．06%。原因能是由于接種量過大，菌體生長(zhǎng)過快，反而抑制了具有抗氧化活性的代謝產(chǎn)物的積累。因此，確定較佳接種量為10%。

2．2．3 裝液量對(duì)發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響 由圖3，C可以看出，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液的自由基清除率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)裝液量為100mL時(shí)，發(fā)酵液DPPH 自由基清除率最高，為90．72%。當(dāng)裝液量繼續(xù)增大時(shí)，自由基清除率又開始減小。因此，確定較佳的搖瓶裝液量為100mL。

圖1 菌株SG0016形態(tài)特征Fig．1 The colony and spore morphology of the SG0016strain

圖2 菌株SG0016PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖譜M．DL2000；1～3均為菌株SG0016Fig．2 The electrophoretogram of PCR products of the SG0016strain M．DL2000；1－3were PCR products of SG0016strain

圖3 培養(yǎng)條件對(duì)發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig．3 Effect of culture conditions on the DPPH free radical scavenging rate of the broth

圖4 碳源對(duì)發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig．4 Effect of carbon sources on the DPPH free radical scavenging rate of the broth

圖5 氮源對(duì)發(fā)酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig．5 Effect of nitrogen sources on the DPPH free radical scavenging rate of the broth

2．2．4 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響 由圖3，D可以看出，培養(yǎng)溫度在20～25℃范圍時(shí)，隨溫度的升高，SG0016菌株發(fā)酵液清除DPPH自由基能力隨之增大。培養(yǎng)溫度為25℃，自由基清除率達(dá)到最大，為89．60%。溫度繼續(xù)升高時(shí)，自由基清除率下降，說明培養(yǎng)溫度過高可能會(huì)抑制SG0016菌株具有抗氧化活性代謝產(chǎn)物積累。因此，確定較佳最佳培養(yǎng)溫度為25℃。

2．2．5 碳源對(duì)發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響 比較了7種不同碳源對(duì)球毛殼菌SG0016菌株發(fā)酵液DPPH 自由基清除能力的影響，結(jié)果（圖4）表明，SG0016菌株可利用試驗(yàn)提供的7種碳源。當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液的DPPH自由基清除率最高，為90．86%；其次為果糖和可溶性淀粉，自由基清除率分別為87．37%和86．75%；乳糖作為碳源時(shí)菌株自由基清除能力最差，僅為18．68%。因此，選擇葡萄糖為球毛殼菌SG0016菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵的較佳碳源。

2．2．6 氮源對(duì)發(fā)酵液DPPH自由基清除率的影響 在碳源試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，比較了7種不同氮源對(duì)球毛殼菌SG0016菌株發(fā)酵液DPPH 自由基清除能力的影響。由圖5可以看出，以酵母浸出膏為氮源時(shí)，發(fā)酵液的DPPH 自由基清除率最高，為91．53%。以尿素為氮源時(shí)，效果最差，自由基清除率僅為18．97%。因此，選擇酵母膏作為較佳氮源。

表2 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Analysis of orthogonal experiments of culture conditions

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析表（完全隨機(jī)模型）Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment（total random model）

2．2．7 正交試驗(yàn)結(jié)果 以接種量、培養(yǎng)溫度、裝液量和培養(yǎng)時(shí)間為影響因素的四因素三水平的正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果見表2和表3。由表2可以看出，B（培養(yǎng)溫度）的極差最大，即對(duì)菌株發(fā)酵液DPPH 自由基清除率影響較大，其次是培養(yǎng)時(shí)間（D）、裝液量（C）和接種量（A）。

利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)方差分析（完全隨機(jī)模型），發(fā)現(xiàn)進(jìn)行試驗(yàn)的4個(gè)因子在99%置信度下對(duì)指標(biāo)的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0．01）。因此，對(duì)于該菌株發(fā)酵液中積累清除DPPH生物活性成分的最佳培養(yǎng)條件組合為B1D1C2A2，即培養(yǎng)溫度23℃、培養(yǎng)時(shí)間7d、裝液量100mL和接種量10%。

2．2．8 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用正交試驗(yàn)獲得的最佳發(fā)酵條件和單因素試驗(yàn)獲得的較佳碳源、氮源進(jìn)行球毛殼菌SG0016 菌株液體發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵液的DPPH 自由基清除率（取3 次試驗(yàn)的平均值）為96．17%，比優(yōu)化前提高了23．6%，說明上述試驗(yàn)獲得的最佳培養(yǎng)條件和碳、氮源有利于SG0016菌株發(fā)酵液中抗氧化活性成分的分泌和積累。

3 討 論

在有關(guān)植物內(nèi)生真菌研究中，經(jīng)常側(cè)重于活性菌株的篩選，而忽略真菌的進(jìn)一步分類鑒定，進(jìn)而導(dǎo)致大量的重復(fù)研究，因此，確定植物內(nèi)生真菌的種屬地位顯得尤為必要。本試驗(yàn)經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定SG0016 菌株為球毛殼菌，將其命名為ChaetomiumglobosumSG0016，杜少康等［13］也從不同地區(qū)的銀杏葉片中分離出多株毛殼菌屬內(nèi)生真菌。球毛殼菌具有多種生物活性［14－15］，國(guó)內(nèi)外對(duì)球毛殼菌，特別是銀杏內(nèi)生球毛殼菌的研究報(bào)道較少。李虎強(qiáng)等［16］從銀杏內(nèi)生真菌球毛殼菌的次生代謝產(chǎn)物中分離得到了12種化合物，找到了抗菌活性較高的膠霉毒素，但并沒有獲得高抗氧化活性的代謝產(chǎn)物。劉小莉等［17］在對(duì)銀杏內(nèi)生真菌抗氧化活性的研究中發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)生炭角菌YX－28的提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在β－胡蘿卜素／亞油酸試驗(yàn)中，其400μg／mL的甲醇粗提物具有72．9%的抑制活性。由于球毛殼菌SG0016菌株具有較高的抗氧化活性，因此對(duì)其進(jìn)一步的開發(fā)利用具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)，確定球毛殼菌SG0016菌株液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度23℃、培養(yǎng)時(shí)間7d、裝液量100mL和接種量10%。在最佳培養(yǎng)條件下，SG0016 菌株發(fā)酵液的DPPH 自由基的清除率可達(dá)96．17%，比優(yōu)化前提高了23．6%。

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