張海靜，胡兆秋，孫玉卿，馮占芹，商洪才，張維芬,Δ

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院，山東 濰坊 261042；2.濰坊市第二人民醫(yī)院，呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 山東 濰坊261041；3.濰坊醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 濰坊 261042；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點實驗室，北京 261053)

?

黃芪多糖對大鼠急性放射性肺損傷的治療作用

張海靜1?，胡兆秋2?，孫玉卿1，馮占芹3，商洪才4，張維芬3,4Δ

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院，山東 濰坊 261042；2.濰坊市第二人民醫(yī)院，呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 山東 濰坊261041；3.濰坊醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 濰坊 261042；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點實驗室，北京 261053)

目的 探討黃芪多糖對大鼠急性放射性肺損傷的治療作用。方法 48只Wistar大鼠隨機分成正常組、模型組、黃芪多糖組、地塞米松組，每組12只。后3組大鼠采用6MV-X 線直線加速器對大鼠雙肺進行照射(20 Gy/次)造模，隨后分別給予0.9%氯化鈉注射液、黃芪多糖(8 mg/mL)和地塞米松(0.05 mg/mL)持續(xù)灌胃治療8周，正常組佯裝照射，給予生理鹽水灌胃于放療后2、8周，每組隨機抽取6只大鼠處死，心臟取血進行白細胞、紅細胞計數(shù)；取各組大鼠右上肺組織，HE染色觀察病理改變。結(jié)果 成功構(gòu)建了放射性肺損傷大鼠模型，一般情況觀察顯示：照射后的大鼠陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡，活動量減少、弓背、脫毛等癥狀，黃芪多糖及地塞米松處理后的大鼠與模型組比較，脫毛等現(xiàn)象逐漸改善。正常組未見任何明顯異常變化。與正常組比較，模型組大鼠血液中白細胞及紅細胞計數(shù)明顯降低(P<0.05)，肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白細胞及紅細胞明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組與黃芪多糖組血液中白細胞及紅細胞計數(shù)明顯回升(P<0.05),且BALF中紅細胞及白細胞明顯降低(P<0.05)；但黃芪多糖組與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肺組織病理學(xué)顯示：模型組較正常組大鼠，肺泡壁破裂、肺泡間隔增寬、肺間質(zhì)增生、肺泡腔及肺間質(zhì)有大量炎性細胞滲出；地塞米松組及黃芪多糖組大鼠均較模型組明顯減輕，但2者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 黃芪多糖能顯著改善大鼠急性放射性肺損傷，作用與地塞米松相近，為放射性肺損傷提供了治療新方法。

放射性肺損傷；黃芪多糖；炎癥細胞；肺泡灌洗液

放射性肺損傷(radio-pulmonary lesion)是胸部惡性腫瘤放射治療常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量并制約著放射劑量的提高[1-2]。目前對于放射性肺損傷的預(yù)防和治療除物理防護措施外，主要側(cè)重于藥物治療，臨床上以糖皮質(zhì)激素為主，但由于應(yīng)用時間長，存在較多不良反應(yīng)。因此，尋求理想的藥物用于治療放射性肺損傷成為當(dāng)今研究的熱點之一[3]。黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是黃芪的主要活性成分之一，主要作用為增強人體的免疫力，并且具有抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等功效[4-5]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，其是否能作為治療放射性肺損傷的新型藥物，對此目前的相關(guān)研究甚少。本實驗旨在建立放射性肺損傷模型，觀察放射性肺損傷大鼠的外周血象及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中白細胞及紅細胞計數(shù)和肺組織病理學(xué)變化來探討黃芪多糖對放射性肺損傷的治療作用，進一步明確APS對放射性肺損傷大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康Wistar大鼠48只，體質(zhì)量150～200 g，雌雄各半，來自山東魯抗動物中心，動物合格證號為：SLXK魯2014002號。

1.1.2 藥品：黃芪多糖(武漢勝天宇科技有限公司，批號20110506)，戊巴比妥鈉(瑞爾欣德，批號69020100)，地塞米松(鄭州市卓峰制藥有限公司，批號13010326)。

1.1.3 儀器：UV-1700紫外分光光度儀(島津國際貿(mào)易有限公司)，邁瑞B(yǎng)C-5300全自動血細胞分析儀(廣州潤和醫(yī)療器械有限公司)，LEICARM 2135 型石蠟切片機(上海仁科生物科技)RM2235切片機(德國LEICA公司)，HC-3618R高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.2 方法

1.2.1 灌胃藥物配制黃芪多糖：準(zhǔn)確稱取黃芪多糖4 mg，加入0.5 mL無菌0.9%氯化鈉注射液中溶解，攪拌均勻，每次實驗前現(xiàn)配，用藥劑量為8 mg/mL，12.5 mL/kg，每天1次。地塞米松：根據(jù)藥理學(xué)實驗動物用藥計算方法，地塞米松大鼠用藥為人的5倍，用藥劑量為地塞米松0.05 mg/mL，每天1次。

1.2.2 分組及給藥：健康Wistar大鼠48只，隨機分成4組，正常組、模型組、黃芪多糖組、地塞米松組，每組12只。黃芪多糖組、地塞米松組大鼠進行放射性肺損傷造模成功后分別給予相應(yīng)黃芪多糖、地塞米松灌胃治療，正常組及模型組給予0.9%氯化鈉注射液灌胃治療，連續(xù)8周。每組分別在第2周、第8周各處死6只大鼠，取標(biāo)本備用。

1.2.3 造模大鼠健康Wistar大鼠，腹腔注射0.3 %戊巴比妥鈉1.2 mL/kg麻醉大鼠，按次序仰臥擺放于照射臺上，調(diào)整照射視野，上至大鼠前肢兩腋窩中點連線，下至劍突水平，照射面積為4.5 cm×4 cm。正常組佯裝照射，其余各組均用6MV-X線全胸單次照射，300 cGy/min，總劑量為20 Gy，照射前用紫外線照射消毒，上述過程于濰坊市濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放療科進行。

1.2.4 標(biāo)本采集及處理:不同處理組的大鼠分別于照射后第2、8周末次給藥后禁食12 h，每組隨機抽取6只，稱重，按照體質(zhì)量給予0.3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，然后固定在蛙板上，打開胸腔，暴露心臟，立刻心臟采血，置于真空采血管中，備用。取血完畢后，在環(huán)狀軟骨上用血管鉗固定器官，其下作倒T形切口，置入連接注射器的靜脈輸液針，固定，結(jié)扎右肺，每次2 mL 0.9%氯化鈉注射液灌洗左肺并收集BALF，經(jīng)4 ℃，1500 r/min離心10 min，棄上清液后儲存于-80 ℃冰箱，備用。收集BALF后，迅速摘取左肺組織，經(jīng)4%甲醛溶液固定，備用。

1.2.5 實驗指標(biāo)利用全自動血細胞分析儀測定血液中的白細胞、紅細胞總數(shù)。BALF中的白細胞及紅細胞計數(shù)，在低倍鏡下利用細胞計數(shù)板計數(shù)，肺組織取材修塊后，進行脫水、浸臘與包埋等處理。用石蠟切片機進行切片，厚度約4 μm，進行HE染色后，利用光學(xué)顯微鏡進行組織病理學(xué)檢查，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 照射后每天對大鼠的精神狀態(tài)、外貌狀況、飲食、飲水及大小便排泄情況進行觀察，共8周。正常組大鼠精神狀況良好，背部毛發(fā)亮澤光滑，飲食及飲水，大小便排泄?fàn)顩r正常；其余3組大鼠照射后陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡、活動遲緩、背部毛發(fā)脫落稀疏、飲食及飲水較少、大小便排泄減少等癥狀；照射后2周，黃芪組及地塞米松多糖組大鼠毛發(fā)及精神狀態(tài)較模型組略有改善，但活動遲緩，飲食及飲水量仍較少；隨著治療時間的延長，癥狀逐漸減輕，照射后8周，黃芪多糖組及地塞米松組大鼠背部毛發(fā)脫落情況逐漸改善，恢復(fù)亮澤且進食及活動量較前增加。2組出現(xiàn)毛發(fā)脫落時間幾乎無差異，且脫毛情況略輕于模型組，但2組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 黃芪多糖對放射性肺損傷大鼠血液中炎性細胞及紅細胞的影響 照射后2、8周，與正常組相比，模型組白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、紅細胞均有明顯降低(P<0.05),表明造模成功。照射后2周，黃芪多糖組與地塞米松組血液中的白細胞及紅細胞計數(shù)明顯升高，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。照射后8周，與正常組比較，黃芪多糖組與地塞米松組白細胞及紅細胞回升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但與模型組相比，正常組、黃芪多糖組與地塞米松組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；照射后8周，黃芪多糖組各指標(biāo)與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1 照射2周后黃芪多糖對大鼠血液中炎性細胞及紅細胞計數(shù)的影響Tab.1 Results of inflammatory cells and red blood cellin blood of rats at 2

*P<0.05，與模型組相比，compared with model group；#P<0.05，與正常組相比，compared with normal group

表2 照射8周后黃芪多糖對大鼠血液中白細胞及紅細胞計數(shù)的影響Tab.2 Results of white blood cell and red blood cellin blood of rats at 8

*P<0.05，與模型組相比，compared with model group；#P<0.05，與正常組相比，compared with normal group

2.3 放射性肺損傷大鼠BALF中細胞計數(shù)對照射后2周及8周的大鼠BALF進行采集，并顯微鏡下細胞計數(shù)。見表3。照射后2、8周，與正常組相比，模型組白細胞、紅細胞均有明顯升高(P<0.05),表明經(jīng)過放射線照射后，大鼠肺部血管內(nèi)皮細胞損傷，血管通透性增加，導(dǎo)致炎癥細胞滲出，組織充血形成了放射性肺損傷模型。照射后2周，黃芪多糖組與地塞米松組血液中白細胞及紅細胞計數(shù)均明顯低于模型組(P<0.05)，說明在放射性肺損傷早期，黃芪多糖與地塞米松均能緩解放射性肺損傷導(dǎo)致的炎癥細胞浸潤及充血現(xiàn)象，且黃芪多糖治療效果與地塞米松無差異。照射8周后，與模型組比較，黃芪多糖組與地塞米松組白細胞及紅細胞計數(shù)均降低(P<0.05)；與正常組相比，黃芪多糖組白細胞及紅細胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但地塞米松組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但黃芪多糖組與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明在放射性肺損傷晚期，黃芪多糖能夠減輕放射性肺損傷導(dǎo)致的充血、炎癥細胞滲出等現(xiàn)象，且治療作用與地塞米松相近。

表3 黃芪多糖對大鼠肺泡灌洗液中白細胞及紅細胞 計數(shù)的影響Tab.3 Results of white blood cell and red blood cell in BALF of rats at 2 w and 8

*P<0.05，與模型組相比，compared with model group；#P<0.05，與正常組相比，compared with normal group

2.4 各組大鼠肺組織肉眼觀察結(jié)果比較 正常組大鼠肺組織表面光滑，呈粉紅色，質(zhì)地柔軟彈性良好且可完全伸展。照射后2周，模型組大鼠肺組織顏色呈暗紅色，質(zhì)地較韌，可見斑片狀出血，輕度腫脹；黃芪多糖組和地塞米松組肺組織呈鮮紅色，質(zhì)地較韌，輕度腫脹，可見少量點狀出血點。照射后8周，模型組大鼠肺組織呈暗紅色，照射區(qū)域表面凹凸不平并呈現(xiàn)灰白色，質(zhì)地變硬，彈性降低，肺組織明顯腫脹且可見明顯灶狀出血點；黃芪多糖組及地塞米松組肺組織呈深紅色，質(zhì)地較韌，輕度腫脹，肺組織出現(xiàn)白色膿點及出血點，與模型組比較程度較輕。

2.5 各組大鼠肺組織病理學(xué)結(jié)果比較 正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，支氣管、肺泡及肺泡壁結(jié)構(gòu)正常，肺間質(zhì)無增生，無炎性細胞浸潤。大鼠2周肺組織HE染色結(jié)果見圖1，模型組大鼠肺泡壁破裂、肺泡間隔增寬、肺間質(zhì)增生、肺泡腔及肺間質(zhì)有大量炎性細胞滲出；黃芪多糖組肺組織結(jié)構(gòu)大致清晰，肺泡間隔增寬，且有炎性滲出物，但較模型組減輕；地塞米松組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清楚，部分肺泡間隔可見炎性滲出，較模型組明顯減少。大鼠8周肺組織HE染色結(jié)果見圖2，模型組大鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞、血管及肺間質(zhì)內(nèi)有充血現(xiàn)象、肺泡間隔增寬斷裂、淋巴細胞浸潤、纖維增生明顯，與正常組比較差異明顯；黃芪多糖組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)大致清晰，僅有少量炎癥細胞浸潤，較模型組明顯減輕；地塞米松組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)大致清晰，少量炎性細胞浸潤，與模型組比較明顯減輕。

圖1 照射2周后各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察(HE，×40)Fig.1 Pathological pictures of lung tissue in different groups after 2 w post-injury(HE，×40)

圖2 照射8周后各組肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察(HE，×40)Fig.2 Pathological pictures of lung tissue in different groups after 2 w post-injury(HE，×40)

3 討論

放射治療是惡性腫瘤治療的一種重要手段，而肺組織對放射較敏感，對于胸部惡性腫瘤施行放射治療容易導(dǎo)致放射性肺損傷。大鼠是常見的構(gòu)建放射性肺損傷的模型生物。杜雪梅等[6]用20 Gy或30 Gy單次劑量射線照射成功建立了放射性肺損傷動物模型。陸忠華等[7]采用12 Gy或20 Gy單次照射成功建立了放射性肺損傷模型。本實驗采用6 MV-X線全胸單次照射，300 cGy/min，總劑量為20 Gy，建立了大鼠放射性肺損傷模型。

黃芪是一種含有多種成分的中藥，報道稱黃芪能夠減輕肺損傷并能夠保護肺泡上皮細胞，調(diào)節(jié)機體免疫力，促進氧自由基的排出，而起到抗纖維化的作用[8-9]。黃芪多糖是從黃芪中提取的主要活性成分，其承載了黃芪的多種優(yōu)良作用，但其是否能夠改善放射性肺損傷，目前對此相關(guān)研究甚少。本實驗結(jié)果顯示大鼠經(jīng)過照射后出現(xiàn)活動遲緩，精神萎靡以及頸背部脫毛、毛發(fā)枯燥等現(xiàn)象，經(jīng)過黃芪多糖以及地塞米松處理后的大鼠上述情況逐漸改善。

放射性治療不僅對腫瘤細胞具有強大的殺傷力，同時對正常組織細胞也具有較強的殺傷力，會明顯降低血液中白細胞及紅細胞水平，同時患者的免疫力也隨之下降[10-13]。目前臨床上治療放射性肺損傷最常用的藥物為糖皮質(zhì)激素[14]。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠血液中白細胞及紅細胞計數(shù)明顯降低，而黃芪多糖組及地塞米松組隨著給藥時間的延長，白細胞及紅細胞呈回升趨勢，且2者無明顯差異，說明黃芪多糖能夠改善放射性肺損傷，作用效果與地塞米松相似。

研究表明經(jīng)過放射性射線照射后，肺部毛細血管內(nèi)皮細胞及肺泡上皮細胞損傷，會進一步導(dǎo)致血液中白細胞及紅細胞計數(shù)降低，及支氣管內(nèi)腔內(nèi)炎癥細胞滲出并充血[15-16]。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠BALF中白細胞及紅細胞計數(shù)明顯升高，說明模型組大鼠經(jīng)過照射后肺部支氣管炎癥細胞滲出并出現(xiàn)充血現(xiàn)象；而經(jīng)過黃芪多糖及地塞米松治療后，BALF中白細胞及紅細胞計數(shù)明顯降低，說明黃芪多糖可減輕放射性肺損傷引起的肺部炎癥及充血現(xiàn)象。與地塞米松相比，黃芪多糖組BALF中細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明2者作用相似，均可以改善放射性肺損傷導(dǎo)致的肺部炎癥細胞滲出及充血現(xiàn)象。

劉純杰等[17]和曹小飛等[18]研究證明放射性肺損傷的病理形態(tài)學(xué)改變主要為肺泡及間質(zhì)充血，炎性細胞浸潤滲出，肺泡間隔增寬，后期可出現(xiàn)纖維組織增生等。在照射后2周，模型組大量炎癥細胞浸潤，肺泡壁破裂，少量纖維結(jié)締組織增生，而黃芪多糖組與地塞米松組大鼠肺組織病理學(xué)顯示炎癥明顯減輕，減輕程度幾乎相同。在照射后8周，模型組大鼠可見肺泡間隔增寬斷裂，炎癥細胞浸潤明顯，纖維增生明顯，而黃芪多糖組及地塞米松組大鼠較模型組明顯減輕，減輕程度大致相同。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了放射性肺損傷大鼠模型，并對其進行藥物干預(yù)，分析了其外周血液及BALF中炎性細胞、紅細胞含量和肺組織病理學(xué)變化，闡明了黃芪多糖能夠明顯改善放射性肺損傷大鼠的生活質(zhì)量及肺部炎癥，其作用于地塞米松大致相同，為黃芪多糖進一步應(yīng)用于臨床治療放射性肺損傷提供了重要的理論依據(jù)。

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(編校：吳茜)

Experimental study of astragaluspolysaccharides on the prevention of radio-pulmonary lesion in Rats

ZHANG Hai-jing1?, HU Zhao-qiu2?, SUN Yu-qing1, FENG Zhan-qin3, SHANG Hong-cai4, ZHANG Wei-fen3,4Δ

(1.College of Clinical Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 2.Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Second People’s Hospital of Weifang, Weifang 261041, China; 3.Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Weifang Medical University, Weifang 261053, China；4.Department of Traditional Chinese Internal Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

ObjectiveTo investigate the effects of astragalus polysaccharides on radio-pulmonary lesion. Methods 48 Wistar rats were divided into normal group, model group, astragalus polysaccharides treated group and dexamethasone treated group, each had 12 rats. Models of radio-pulmonary lesion of rats in later three groups were established by whole-thorax irradiation 20 Gy, then normal group was pretending to irradiation. Rats in normal group and model group were given 0.9% NaCl, astragalus polysaccharides treated group and dexamethasone treated group were given astragalus polysaccharides(8mg/mL) and dexamethasone(0.05mg/mL), accordingly. All rats were with 8 weeks, at 2 w and 8 w post-injury, 6 rats in each group were selected randomly and anesthesia to death. The erythrocytes and leukocytes in blood and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) in each group were detected and histological examination of lung tissues were performed by Haematoxylin and Eosin staining to study general morphology. ResultsRadiation-induced lung injury rat model were successfully constructed, general observation showed that irradiated rats gradually appear listlessness, reduce the volume of activities, arched, hair removal and other symptoms, astragalus polysaccharide (APS) and dexamethasone treated rats had gradual improvement than model group. Compared with control group, erythrocytes and leukocytes counts in serum of model group at 2 w and 8 w post-injury were significantly decreased(P<0.05), the numbers of erythrocytes and leukocytes in BALF were significantly increased(P<0.05).Compared with model group group, the leukocytes, erythrocytes and neutrophils counts in serum of astragalus polysaccharides treated group and dexamethasone treated group were all increased(P<0.05), respectively, and the number of leukocytes and erythrocytes in BLAF were significantly decreased(P<0.05). All the indexes between two groups had no significant difference. The pathological changes of lung tissues showed that rats in model group had rupture alveolar wall, widened alveolar interval, pulmonary interstitial hyperplasia, and the alveolar space and interstitial lung stroma had a large number of inflammatory cells exudation. The symptoms in astragalus polysaccharides treated group and dexamethasone treated group were all alleviated, and there was no significant difference between the two groups. ConclusionAstragalus polysaccharides have therapeutic effect on radio-pulmonary lesion in rats, and the therapeutic effects of astragalus polysaccharides are roughly similar to dexamethasone. Further research is needed to elucidate the mechanism behind the effects of astragalus polysaccharides in order to develop appropriate treatment.

radio-pulmonary lesion; astragaluspolysaccharides; inflammation cells; bronchoalveolar lavage fluid

國家科技部星火科技計劃項目(2013GA740103)；國家自然科學(xué)基金(81573717)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2012CM025)；山東省科技攻關(guān)(2012YD18063)

張海靜，女，碩士在讀，研究方向：呼吸系病學(xué),E-mail:：zhanghaijingwin@163.com；胡兆秋，共同第一作者，男，副主任醫(yī)師，研究方向：呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)，E-mail:zhaoqiuhu@126.com;張維芬，通訊作者，女，博士，碩士生導(dǎo)師、教授，研究方向：藥物新劑型與生物材料，E-mail:：zwf2024@126.com

R563.8

A

1005-1678(2015)09-0008-04