鄭立波　李麗　張小慧　尹慧　劉艷紅　董銀卯

近年來(lái)，隨著歐盟對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的取締，體外替代實(shí)驗(yàn)逐漸引起人們的廣泛關(guān)注。本文利用SkinEthic^TM重組皮膚模型對(duì)無(wú)水乳液的刺激性進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該實(shí)驗(yàn)條件下所測(cè)得的數(shù)據(jù)符合OECD規(guī)定。10%Vc油包醇體系、10%Vc油包水體系、純油體系樣品對(duì)SkinE也ic^TM重組皮膚模型顯示無(wú)刺激性。

自2009年3月歐盟正式公布禁止使用動(dòng)物進(jìn)行化妝品毒性和過(guò)敏實(shí)驗(yàn)，體外代替實(shí)驗(yàn)逐步引起人們的廣泛關(guān)注。1975年Rhein Waldg和Green通過(guò)培養(yǎng)上表皮細(xì)胞，成功獲得皮膚模型，并成功用于皮膚缺損創(chuàng)面的治療。從此，皮膚模型得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。研究報(bào)道多應(yīng)用于化學(xué)品、化妝品的刺激性、腐蝕性實(shí)驗(yàn)、功效性評(píng)價(jià)、透皮吸收性等方面的研究。2013年7月26日，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for EconomicCo-operation and DevelopmentOECD）對(duì)皮膚模型的具體要求及操作方式提出了新的更具體的要求，使得皮膚模型逐步商業(yè)化，操作更加具體化。

皮膚模型的優(yōu)勢(shì)如下：可測(cè)定化合物經(jīng)皮吸收后對(duì)皮膚內(nèi)部細(xì)胞的影響；重復(fù)性高：取自不同人群的皮膚，更具說(shuō)服力；適用于各種劑型藥物；可部分替代動(dòng)物刺激性實(shí)驗(yàn)，減少輿論；靈敏度、特異性高和精確性好。

無(wú)水乳化體系主要包括油包多元醇、油包油體系。無(wú)水乳液作為一種新的化妝品劑型，在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，國(guó)外對(duì)無(wú)水乳液的報(bào)道也較少，多數(shù)是對(duì)于藥物緩釋、物質(zhì)穩(wěn)定性方面的報(bào)道。無(wú)水乳液有下列優(yōu)點(diǎn)：①對(duì)功效成分具有緩釋的效果；②能夠溶解水不溶性或在水中不穩(wěn)定的功效成分；③內(nèi)相承載物質(zhì)后能夠與外相分割，防止與空氣接觸后發(fā)生氧化變性；④通過(guò)外層對(duì)油相的包裹，滋潤(rùn)效果更好；⑤在藥物制劑中，很多功效成分溶于水后有難以下咽的味道，無(wú)水乳化對(duì)于嬰兒或者難以下咽藥片的老人有很好的幫助。

近年來(lái)，由于無(wú)水體系的諸多優(yōu)點(diǎn)，人們也開(kāi)始對(duì)這一配方體系進(jìn)行研究。但無(wú)水乳液不溶于水這一性質(zhì)致使其安全性不適合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。重組皮膚模型適合于檢測(cè)各種劑型的化妝品，化學(xué)品。所以，本文采用SkinEthic^TM重組皮膚模型對(duì)無(wú)水乳液的刺激性進(jìn)行研究。為以后3-D皮膚模型應(yīng)用與化妝品的安全性檢測(cè)提供參考。

材料與方法

1.材料

SkinEthic^TM（購(gòu)于美國(guó)MatTek公司）、含10%Vc的硅油包多元醇無(wú)水乳液、含10%Vc的硅油包水乳液、功能油（三個(gè)樣品均由北京工商大學(xué)研制）

2.儀器與試劑

*儀器：4℃的冰箱[MBR-107D（H）]、二氧化培養(yǎng)箱（ThermoForma 3111）、超凈工作臺(tái)[MCV-B91S（T）/Bgl F（T）]，倒置顯微鏡（OlymPuslX5）、不同量程移液槍（德國(guó)Eppendorf），酶標(biāo)儀（BiokitELX800）*試劑耗材：標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基和相應(yīng)的緩沖液（Sigma）、胰酶（ScienCell）、DPBS、異丙醇（Sigma）、MTT實(shí)驗(yàn)所需耗材、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（T175）、尼龍布，無(wú)菌鉗，一次性滅菌移液管、吸管，6孔板、24孔板、96孔板。

3.試驗(yàn)方法

（1）樣品準(zhǔn)備：5%SDS為陽(yáng)性對(duì)照，DPBS為陰性對(duì)照。選取6個(gè)測(cè)試樣品待用。

（2）收到樣品當(dāng)天應(yīng)檢查皮膚是否完整，有無(wú)異常，將DPBS置于（5±3）℃冰箱中，將MTT溶液置于（-20±5）?！姹渲?。

（3）將皮膚模型用無(wú)菌鉗取出后用紗布蘸取其底部的多余瓊脂糖后將其置于空的24孔板中。檢查皮膚是否完整，將表面多余的水分盡量吸干。此過(guò)程應(yīng)在5min之內(nèi)完成。

（4）培養(yǎng)基預(yù)熱至20～25℃，在6孔板中加入0.9mL的培養(yǎng)基，用無(wú)菌鉗取出皮膚后將皮膚模型轉(zhuǎn)移到6孔板中。在（37±1）℃，（5±1）%培養(yǎng)（60±5）min（使其中的固定物釋放）。將皮膚模型轉(zhuǎn)移到新的含0.9mL培養(yǎng)基的6孔板中，在（37±1）℃，（5±1）%CO₂條件下培養(yǎng)（18±3）h。

（5）將皮膚模型轉(zhuǎn)移到含新的0.9mL培養(yǎng)基的6孔板中，用尼龍布將皮膚表面的液體吸凈。

將受試物加至人造皮膚模型表面（固體先加25uL蒸餾水后加25mg樣品，液體吸取30μL樣品）后，加一層尼龍布，使樣品分散均勻。用接種環(huán)將樣品分散均勻。每個(gè)樣品做三個(gè)平行試驗(yàn)。將樣品放在（37±1）℃，（5±1）%CO₂條件下孵育35min后將皮膚從培養(yǎng)箱中取出，直到皮膚與樣品接觸60min為止。

（6）樣品暴露（60±1）min后，立即用DPBS多次沖洗組織。后用尼龍布將皮膚表面的DPBS吸凈，將其換入新的含0.9mL培養(yǎng)基的6孔板中培養(yǎng)（24±2）h。

（7）（24±2）h后收集培養(yǎng)基，置于24孔板中，利用試劑盒測(cè)定其白介素含量。同時(shí)將皮膚轉(zhuǎn)移到新的含0.9mL培養(yǎng)基的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)（18±2）h。

（8）培養(yǎng)液后將皮膚組織進(jìn)行沖洗后轉(zhuǎn)移到300uL的MTT溶液中避光保存，進(jìn)行MTT染色。

（9）MTT染色后，去除MTT溶液，用DPBS沖洗兩次，將皮膚轉(zhuǎn)移到2mL的異丙醇中。提取細(xì)胞中的甲躦。

（10）將提取液轉(zhuǎn)移到96孔板中，在550～570nm下測(cè)定吸光度。受試物的吸光度與陰性對(duì)照比較。以樣品相對(duì)于陰性對(duì)照的細(xì)胞存活率的變化來(lái)評(píng)估受試物的潛在刺激性。

相對(duì)細(xì)胞活率百分?jǐn)?shù)=（樣品平均吸光度值/陰性對(duì)照的平均吸光度值）×100%

4.判定標(biāo)準(zhǔn)

（1）陰性對(duì)照可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：在570nmT其OD值X應(yīng)滿足1.0

（2）陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照組細(xì)胞存活率的比值應(yīng)<20%

（3）各個(gè)樣品的SD<18%

（4）在上述情況下其細(xì)胞活率若>50%為無(wú)刺激，細(xì)胞活率若≤50%為有刺激。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如下圖所示：為檢測(cè)化學(xué)品、化妝品刺激性的實(shí)驗(yàn)方法之一。本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了3種產(chǎn)品對(duì)SkinEthic^TM重組皮膚模型的刺激性，最終判斷了10%Vc油包醇體系，10%Vc油包水體系、純油體系對(duì)SkinEthic^TM重組皮膚模型無(wú)刺激性。

由圖1可知，陰性對(duì)照組在570nm下其OD值×=2.2534<20%；陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照組細(xì)胞存活率的比值=3.3616/99.9978×1D0%=3.3617%<20%；其中各個(gè)樣品的SD<18%，所以，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合OEcD規(guī)定。利用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得其細(xì)胞活率分別為97.90%、107.11%、120.65%，所以判定10%Vc油包元醇體系、10%Vc油包水體系、純油體系對(duì)SkinEthic^TM重組皮膚模型無(wú)刺激性。

討論

體外重組皮膚模型是取自人體具有增殖能力的細(xì)胞后，種植于具有生物兼容性的高分子材料中，通過(guò)原代培養(yǎng)，獲得具有類似于人體皮膚的模型結(jié)構(gòu)。根據(jù)其皮膚模型所含皮膚的層數(shù)及深度，主要包括單層細(xì)胞模型、表皮模型，復(fù)層皮膚模型。其中，復(fù)層皮膚檢測(cè)模型結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚刺激實(shí)驗(yàn)替代的理想模型。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)可知：在此條件下，SkinEthic^TM重組皮膚模型可以滿足OECD的各項(xiàng)規(guī)定，可作為以后皮膚模型在化妝品刺激性方面的應(yīng)用提供參考。