朱大恒，楊增光，張可可，丁騰閣，張綿綿，鄒春陽，閆曉靜，王婧芬，賈英勃，席宇

鄭州大學生命科學學院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學大道100號 450001

干酪乳桿菌發(fā)酵廢棄煙梗制備L-乳酸操作參數(shù)的優(yōu)化

朱大恒，楊增光，張可可，丁騰閣，張綿綿，鄒春陽，閆曉靜，王婧芬，賈英勃，席宇*

鄭州大學生命科學學院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學大道100號 450001

采用單因子試驗研究了6個操作參數(shù)（發(fā)酵方式、發(fā)酵時間、裝載量、接種量、發(fā)酵溫度及初始pH）對干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）XJL發(fā)酵廢棄煙梗制備L-乳酸的影響。根據(jù)單因素試驗結果，選取接種量、裝載量、初始pH及發(fā)酵溫度進行四因素三水平正交試驗。結果表明：①初始pH、接種量和裝載量對L-乳酸的產(chǎn)率影響顯著。②最優(yōu)操作參數(shù)組合為初始pH 7.0、裝載量120/250 mL（250 mL的錐形瓶裝載120 mL的廢棄煙梗提取液）、接種量（種子液的移入體積與接種后培養(yǎng)液體積的比例）7.5%、37℃靜置培養(yǎng)48 h；此條件下，廢棄煙梗發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸可達157.50 g/kg。

乳桿菌；L-乳酸；煙梗；操作參數(shù)；發(fā)酵

Keywords:Lactobacillus；L-lactic acid；Tobacco stem；Operational parameter；Fermentation

乳酸作為一種重要的化工原料，可通過生物或化學途徑轉(zhuǎn)化成一系列具有重要用途的衍生物，如乳酸酯、丙酮酸、丙烯酸和聚乳酸（PLA）等［1-2］。聚乳酸及其改性產(chǎn)品是可生物降解的新型高分子材料，在農(nóng)、林、漁、工、醫(yī)等領域應用廣泛［3］。在煙草行業(yè)，添加乳酸能夠有效降低卷煙煙氣的pH，提高凝聚性和舒適性，改善卷煙的抽吸品質(zhì)［4-5］。目前，微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)乳酸的重要途徑；隨著市場需求量的日益擴大，尋求工農(nóng)業(yè)廢棄物等廉價發(fā)酵底物，降低發(fā)酵成本已成為乳酸工業(yè)的一個研究熱點［6-9］。

煙梗是煙葉加工過程中產(chǎn)生的廢棄物［10］，其中僅有40%左右通過造紙法再造煙葉等技術被有效利用［11］，大量的廢棄煙梗造成了資源浪費和環(huán)境污染。煙梗中含有大量水溶性糖類和硝酸鹽等［12-13］，因此對廢棄煙梗進行資源化利用具有重要意義。目前，以廢棄煙梗為主要原料制備活性炭［14-15］、木質(zhì)陶瓷［16-17］、吸附劑［18-19］及人工草炭［20］等已有報道，但上述研究主要集中在對廢棄煙梗中質(zhì)量分數(shù)不到20%的粗纖維組分的利用方面［12］，綜合利用程度不高。廢棄煙梗中的可溶性成分可作為廉價底物通過微生物發(fā)酵制備生物殺蟲劑［21］、酵母菌［22］、真菌吸附劑［23］等。朱大恒等［24-26］分離的一株干酪乳桿菌XJL能夠發(fā)酵廢棄煙梗制備L-乳酸，發(fā)酵過程中的操作參數(shù)可對結果產(chǎn)生重要影響。因此，對影響XJL發(fā)酵制備L-乳酸的6個主要操作參數(shù)進行了優(yōu)化，獲得了發(fā)酵的最佳操作參數(shù)組合，以期為L-乳酸的規(guī)模化制備提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

廢棄煙梗由河南天昌煙草國際有限公司提供，長度為0.2～5.0 cm，直徑為0.15～0.50 cm。

瓊脂粉購于美國Sanland公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；JJ300電子天平（感量0.001 g，常熟雙杰儀器廠）；PHS-3C pH計（上海鵬順科學儀器有限公司）；HZQ-X100恒溫搖床（太倉市實驗設備廠）；XFH-50CA電熱式壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SBA-40D生物分析傳感儀（山東省科學院生物研究所）。

1.2 方法

1.2.1 菌株及培養(yǎng)基

干酪乳桿菌XJL為本實驗室分離鑒定的一株可發(fā)酵廢棄煙梗產(chǎn)L-乳酸的菌株［24］，XJL的保存和活化均采用MRS固體培養(yǎng)基［27］，瓊脂的質(zhì)量分數(shù)為1.8%。L-乳酸的發(fā)酵制備采用廢棄煙梗提取液（Tobacco stem extraction,TSE）培養(yǎng)基，其制備方法參考文獻［24］進行，培養(yǎng)基滅菌條件均為115℃滅菌20 min。TSE的初始pH采用4 mol/L的鹽酸溶液或5 mol/L的氫氧化鈉溶液進行調(diào)節(jié)，采用精密pH計進行測量。

1.2.2 L-乳酸的發(fā)酵制備及操作參數(shù)的優(yōu)化

采用在250 mL錐形瓶中發(fā)酵的方法，研究不同的發(fā)酵方式、發(fā)酵時間、裝載量、接種量，發(fā)酵溫度及初始pH對L-乳酸產(chǎn)率的影響。將XJL平板培養(yǎng)物接種到含100 mL TSE培養(yǎng)液（pH 5.5）的250 mL錐形瓶中，在37℃和180 r/min的條件下培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)物作為種子液進行發(fā)酵試驗。以溫度37℃、接種量5%（移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例）、裝載量100/250 mL（250 mL的錐形瓶裝載100 mL的TSE）、發(fā)酵時間48 h及初始pH 5.5靜置發(fā)酵為基礎試驗條件，通過每次改變一個參數(shù)水平分別進行單因子試驗。根據(jù)單因子實驗結果選取對L-乳酸產(chǎn)率有較大影響的操作參數(shù)進行正交試驗，通過直觀分析和方差分析確定最佳參數(shù)條件。單因子及正交試驗均設置2次重復，結果取平均值。

1.2.3 發(fā)酵液中L-乳酸濃度的測定及產(chǎn)率的計算

干酪乳桿菌XJL發(fā)酵僅產(chǎn)生L-乳酸，因此發(fā)酵后TSE中L-乳酸的濃度（g/L）采用生物分析傳感儀進行測定?？紤]到本研究的最終目的是資源化利用廢棄煙梗，目前主要集中在如何提高發(fā)酵液中L-乳酸的濃度方面，尚未開展對發(fā)酵液中L-乳酸的提取工作，因此試驗結果采用煙梗發(fā)酵制備L-乳酸的產(chǎn)率（g/kg）來表示。根據(jù)煙梗質(zhì)量和水體積的比例為1∶10（kg∶L）時，每千克煙?？芍苽?.5 L的TSE，因此每千克煙梗發(fā)酵后L-乳酸的產(chǎn)率（g/kg）即為發(fā)酵后TSE中L-乳酸濃度（g/L）的7.5倍。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 操作參數(shù)對L-乳酸產(chǎn)率的影響

2.1.1 發(fā)酵方式

干酪乳桿菌是一種兼性厭氧菌，采用靜置和振蕩兩種培養(yǎng)方式來比較發(fā)酵方式對產(chǎn)酸的影響，結果見圖1。在靜置培養(yǎng)條件下，L-乳酸的產(chǎn)率可達131.25 g/kg。振蕩培養(yǎng)對產(chǎn)酸的影響較大，振蕩轉(zhuǎn)速為60 r/min時產(chǎn)率為127.50 g/kg，與靜置培養(yǎng)時相差不大；隨著轉(zhuǎn)速的增大，產(chǎn)酸量明顯下降，轉(zhuǎn)速為120 r/min時，產(chǎn)率為108.75 g/kg。轉(zhuǎn)速與發(fā)酵體系的溶氧有關，轉(zhuǎn)速越高，溶氧相對越高［28］。試驗結果表明，低溶氧條件下更有利于L-乳酸的產(chǎn)生。與振蕩培養(yǎng)相比，靜置培養(yǎng)不僅節(jié)約能耗，還可提高產(chǎn)酸量。因此以下試驗均采用靜置方式進行發(fā)酵。

圖1 發(fā)酵方式對L-乳酸產(chǎn)率的影響

2.1.2 發(fā)酵時間

L-乳酸的產(chǎn)生與發(fā)酵時間有顯著的關系。從圖2可看出，發(fā)酵6～30 h時，L-乳酸產(chǎn)率從41.25 g/kg增至120.00 g/kg。隨著TSE中糖的消耗及乳酸的累積，產(chǎn)酸速率顯著下降，繼續(xù)發(fā)酵至48 h時，L-乳酸的產(chǎn)率僅增加15.00 g/kg；發(fā)酵48 h后，產(chǎn)酸量基本保持不變，表明發(fā)酵達到終點，此時L-乳酸的產(chǎn)率為135.00 g/kg?？s短發(fā)酵周期是優(yōu)化發(fā)酵過程中操作參數(shù)的重要目的之一，因此可通過菌種改良方法提高菌株的耐酸性或添加適當?shù)闹泻蛣﹣斫獬┒水a(chǎn)物的抑制效應，縮短發(fā)酵周期。

圖2 發(fā)酵時間對L-乳酸產(chǎn)率的影響

2.1.3 發(fā)酵裝載量

裝載量是影響發(fā)酵體系溶氧量的另一個重要操作參數(shù)，裝載量越低，溶氧量相對就越高［29］。不同裝載量對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響結果見圖3。在250 mL錐形瓶中，當裝載量為120～160 mL時產(chǎn)酸量相對最高，產(chǎn)率均為135.00 g/kg。當裝載量低于120 mL時產(chǎn)率逐漸降低，裝載量越低，產(chǎn)率越低，裝載量為60 mL時產(chǎn)率最低，為105.00 g/kg；當裝載量為180 mL時產(chǎn)率又略微降低。這可能由于溶氧過小，影響菌體初期的繁殖生長，導致菌體濃度過低，因此選擇合適的裝載量可以有效提高產(chǎn)酸量。

圖3 裝載量對L-乳酸產(chǎn)率的影響

2.1.4 發(fā)酵接種量

接種量對L-乳酸產(chǎn)率的影響見圖4。結果表明，接種量越大產(chǎn)率越高，當接種量在7.5%～12.5%時，L-乳酸的產(chǎn)率最高為135.00 g/kg；當接種量低于7.5%時，產(chǎn)酸量逐漸降低。這可能是由于XJL的延滯期過長造成的。然而，與12.5%的接種量相比，接種量為15%時的產(chǎn)酸量反而略微下降，這可能與發(fā)酵時過大的接種量導致發(fā)酵液中糖濃度略微降低有關。

圖4 接種量對L-乳酸產(chǎn)率的影響

2.1.5 發(fā)酵溫度

溫度是影響菌體生長和產(chǎn)酸的重要環(huán)境參數(shù)，適宜的溫度條件可以促進細胞的生長，提高發(fā)酵的產(chǎn)酸量。不同發(fā)酵溫度對L-乳酸產(chǎn)率的影響見圖5。在20～45℃范圍內(nèi)菌株XJL均能正常生長產(chǎn)生L-乳酸，低于28℃或者高于42℃，產(chǎn)酸均明顯下降；最適宜產(chǎn)酸溫度范圍為35～40℃，37℃時產(chǎn)率最高，可達131.25 g/kg。這與文獻［26］報道的牛鏈球菌的最適宜產(chǎn)酸溫度為37℃一致。

圖5 溫度對L-乳酸產(chǎn)率的影響

2.1.6 初始pH

初始pH對L-乳酸產(chǎn)率的影響如圖6。從圖6可看出，在pH為4.5～7.5的范圍內(nèi)，菌株XJL均能發(fā)酵產(chǎn)酸，產(chǎn)率的最大值為135.00 g/kg，對應的pH為6.5。這與文獻［8］報道的芽孢桿菌NL01的最適宜產(chǎn)酸pH為6.3比較接近。當pH小于5.5或大于6.5時，產(chǎn)酸量逐漸下降。這可能是由于該pH范圍內(nèi)XJL菌體生長緩慢，對糖類利用率較低，導致發(fā)酵周期內(nèi)產(chǎn)酸過低。

圖6 初始pH對L-乳酸產(chǎn)率的影響

2.2 正交試驗的直觀分析

通過對單因子試驗結果分析，選取發(fā)酵溫度、初始pH、接種量及裝載量4個對產(chǎn)酸影響較大的操作參數(shù)進行四因素三水平正交試驗。發(fā)酵溫度、初始pH和接種量正交試驗水平在單因子試驗的最高值附近選擇?？紤]到下一步的放大試驗還需要補加營養(yǎng)成分及中和劑等操作，因此裝載量選擇80、100和120 mL 3個水平。試驗選用操作參數(shù)水平及試驗結果的直觀分析見表1。從直觀分析的極差R值可看出在試驗所選的水平范圍內(nèi)4個操作參數(shù)對產(chǎn)酸影響的順序是：B＞C＞D＞A，即初始pH＞接種量＞裝載量＞發(fā)酵溫度，發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的最優(yōu)組合為A2B3C3D3，即溫度37℃、初始pH 7.0、接種量7.5%和裝載量120/250 mL。

表1 煙梗發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸正交試驗因素水平及試驗結果的直觀分析①

2.3 正交試驗結果的方差分析

正交試驗結果的方差分析見表2，操作參數(shù)B、C和D的P＜0.01，因此初始pH、接種量和裝載量對L-乳酸的產(chǎn)生均具有極顯著的影響。表1的9組試驗組合中沒有最優(yōu)組合A2B3C3D3，因此選擇該組合進行追加試驗（n=2）。結果表明，在優(yōu)化的操作參數(shù)條件下，以廢棄煙梗為唯一基質(zhì)L-乳酸的最高產(chǎn)率可達157.50 g/kg。

表2 L-乳酸發(fā)酵正交試驗的方差分析

3 小結

①與振蕩發(fā)酵相比，靜置發(fā)酵產(chǎn)酸量相對較高，節(jié)約能耗。②初始pH、接種量和裝載量對L-乳酸產(chǎn)率有極顯著影響，最優(yōu)產(chǎn)酸條件為：溫度37℃、pH 7.0、裝載量120/250 mL和接種量7.5%；在該條件下，L-乳酸的產(chǎn)率為157.50 g/kg。與前期的研究結果［24］相比，L-乳酸的產(chǎn)率提高10.14%。③干酪乳桿菌XJL發(fā)酵產(chǎn)酸的溫度范圍較廣，因此廢棄煙?？蔀長-乳酸的規(guī)?；l(fā)酵制備提供一種廉價的潛在基質(zhì)。

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責任編輯 茹呈杰

Optimization of Operational Parameters for Preparation of L-lactic Acid by Fermentation of Waste Tobacco Stems withLactobacillus casei

ZHU Daheng,YANG Zengguang,ZHANG Keke,DING Tengge,ZHANG Mianmian,ZOU Chunyang, YAN Xiaojing,WANG Jingfen,JIA Yingbo,and XI Yu*
School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China

Monofactorial experiments were performed to study the effects of six operational parameters, including fermentation means,fermentation duration,loading capacity,inoculum size,temperature and initial pH,on the preparation of L-lactic acid by the fermentation of waste tobacco stems with Lactobacillus casei XJL.According to the results of monofactorial experiments,four factors（inoculum size,loading capacity,initial pH and temperature）were selected and orthogonally tested at three levels. The results showed that:1）Initial pH,inoculum size and loading capacity significantly affected the yield of L-lactic acid.2）The optimum operational parameters were initial pH 7.0,loading capacity 120/250 mL（120 mL tobacco stem extraction loaded in a conical flask of 250 mL）,inoculum size 7.5%（the volume ratio of transferred inoculant solution to total culture solution after inoculation）,static culture for 48 hours at 37℃;under the above conditions,the maximum yield of L-lactic acid reached 157.50 g/kg.

TS414

A

1002-0861（2015）11-0022-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151105

2014-10-16

2015-07-21

河南省高等學校重點科研項目“干酪乳桿菌XJL發(fā)酵廢棄煙梗水提取物產(chǎn)L-乳酸的響應面優(yōu)化研究”（15B180020）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃資助項目“干酪乳桿菌XJL發(fā)酵廢棄煙梗水提取物產(chǎn)L-乳酸的研究”（2015xjxm208）；河南省煙草公司科技項目“煙草基質(zhì)有機酸發(fā)酵與資源利用生物工程”（HYKJ201125）。

朱大恒（1965—），博士，教授，主要從事微生物工程研究。E-mail:zhudaheng2000@aliyun.com.cn;*

席宇，E-mail:microxy@126.com

朱大恒，楊增光，張可可，等.干酪乳桿菌發(fā)酵廢棄煙梗制備L-乳酸操作參數(shù)的優(yōu)化［J］.煙草科技，2015，48（11）：22-27.

ZHU Daheng，YANG Zengguang，ZHANG Keke，et al.Optimization of operational parameters for preparation of L-lactic acid by fermentation of waste tobacco stems with Lactobacillus casei［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：22-27.