王穎，馬玲玲，呂欣*，趙德學，黃仲波

1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西省咸陽市楊凌區(qū)西農(nóng)路28號 712100

2.陜西中煙工業(yè)有限責任公司，西安市雁塔區(qū)灃惠南路38號 710065

單一和復配微生物固態(tài)發(fā)酵對卷煙葉組主要化學成分的影響

王穎*1,2，馬玲玲*1，呂欣**1，趙德學2，黃仲波2

1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西省咸陽市楊凌區(qū)西農(nóng)路28號 712100

2.陜西中煙工業(yè)有限責任公司，西安市雁塔區(qū)灃惠南路38號 710065

為研究單一菌株和復配菌株對卷煙葉組化學成分的影響，考察了固態(tài)發(fā)酵過程中3株微生物（酵母菌LBT1.0038，芽孢桿菌LBT1.0007和LBT1.0013）對卷煙葉組碳水化合物、含氮化合物、有機酸、氨基酸和石油醚提取物等主要化學成分的影響。結(jié)果表明：與對照葉組相比，用單一菌株和復配菌株發(fā)酵時，葉組的淀粉含量（質(zhì)量分數(shù)，下同）均顯著下降，且水溶性糖總量也呈下降趨勢；葉組的總氮含量變化不顯著，可溶性蛋白質(zhì)含量下降，氨基酸總量升高。用單一菌株或低施加量復配菌株發(fā)酵時，葉組有機酸總量升高。用復配菌株發(fā)酵時，葉組的石油醚提取物含量顯著增加。單一和復配菌株均對葉組主要化學成分有影響，但復配菌株對葉組化學成分的影響不呈現(xiàn)疊加效應，其中芽孢桿菌在降解蛋白質(zhì)和淀粉等方面起主要作用，而酵母菌對葉組總氮和石油醚提取物有顯著影響。

微生物；菌株；卷煙葉組；固態(tài)發(fā)酵；化學成分

煙葉表面微生物數(shù)量龐大、種類繁多，它們在煙葉發(fā)酵過程中起到重要作用［1］。將微生物及其制劑作用于煙葉表面，可縮短發(fā)酵時間、提高煙葉香味物質(zhì)含量、改善煙葉香氣和吸味［2-4］，這是由于微生物作用于煙葉表面后，將煙葉中大分子物質(zhì)降解為單糖、氨基酸和有機酸等多種小分子成分，這些小分子再進一步反應或者降解為醇、醛、酸、酯等致香成分，從而改善煙葉吸食品質(zhì)［5］。同時，將微生物應用于煙葉醇化，還可以降低卷煙煙氣中有害成分的釋放量［6］。近年來，將從煙葉表面分離的微生物菌株應用于煙葉發(fā)酵已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點之一［7］。在前期研究中，考察了單一菌株對煙葉品質(zhì)的影響［8-9］，并建立了基于微生物固態(tài)發(fā)酵的卷煙生產(chǎn)工藝［10-12］，結(jié)果表明，通過分離煙葉表面的微生物并將其用于卷煙葉組固態(tài)發(fā)酵，可以開發(fā)具有特定感官風格及更低煙氣有害成分釋放量的卷煙新產(chǎn)品。目前復配菌株及單一菌株對葉組主要化學成分的影響尚不清楚，因此，考察了上述卷煙葉組發(fā)酵過程中，單一菌株和復配菌株對葉組主要化學成分的影響，旨在為研究微生物固態(tài)發(fā)酵對改善卷煙葉組吸食品質(zhì)的影響提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

“好貓（天賦）”牌卷煙葉組（陜西中煙工業(yè)有限責任公司提供）；菌株：酵母菌（Saccharomyces sp.）LBT1.0038，芽孢桿菌（Bacillus sp.）LBT1.0007和芽孢桿菌（Bacillus sp.）LBT1.0013；復配菌株：由上述單一菌株按1∶1∶1比例復配制成。

硼酸、氫氧化鈉、檸檬酸鈉、硫酸鉀、五水硫酸銅（AR），濃硫酸（GR）（廣東光華科技股份有限公司）；二氯甲烷（HPLC級，天津市科密歐化學試劑有限公司）；石油醚（沸程30～60℃，AR，天津博迪化工股份有限公司）；蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、琥珀酸（99.5%，質(zhì)量分數(shù)，下同），果糖、草酸（99%），蘋果酸、乳酸（98%），直鏈淀粉、支鏈淀粉（100%）（美國Sigma公司）；去離子水（自制）。

L-8900全自動氨基酸分析儀（日本Hitachi公司）；721可見光分光光度計（上海精密科學儀器有有限公司）；KjeltecTM8400全自動凱氏定氮儀（瑞典FOSS公司）；Waters 1525高效液相色譜儀（美國Waters公司）；索氏提取裝置（自制）；AL104電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 卷煙葉組的固態(tài)發(fā)酵

采用文獻［10］的方法進行卷煙葉組的固態(tài)發(fā)酵。其中復配菌株的制備如下：將單一菌株的菌懸液按1∶1∶1比例混合，離心并棄去上清液后得到濕菌體，再用5 mL無菌去離子水重懸后即得復配菌株。將所得重懸菌體均勻噴施于煙葉表面進行發(fā)酵。對照樣品為噴施等量無菌去離子水的葉組，其余各試驗葉組所噴施微生物如表1所示。低溫烘絲后，將葉組粉碎后過0.42 mm（40目）篩，于24℃、相對濕度65%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中平衡24 h。

表1 試驗編號及說明①

1.2.2 卷煙葉組主要化學成分的測定

采用流動分析法測定淀粉和總氮［13-14］，液相色譜法測定水溶性糖蔗糖、葡萄糖和果糖［15］，考馬斯亮藍G250比色法測定可溶性蛋白質(zhì)［16］，氨基酸分析儀法測定氨基酸［17］，高效液相色譜法測定有機酸［18］，分別采用文獻［19-20］的方法測定總植物堿、總揮發(fā)堿以及石油醚提取物。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

卷煙葉組的化學指標均重復測定3次，計算其平均值和標準差，并用SPSS軟件進行方差分析，采用Duncan新復極差法進行多重比較以研究不同指標下各組處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 卷煙葉組糖分的變化

通常，淀粉含量過高會導致煙草的吸食品質(zhì)下降［5,21］，因而淀粉含量降低有助于改善卷煙葉組的感官品質(zhì)。發(fā)酵后卷煙葉組中淀粉和可溶性糖的含量（表2）表明：①與對照葉組（JC00）相比，單一菌株和復配菌株均使卷煙葉組的淀粉含量顯著降低。②單一菌株和復配菌株對葉組中淀粉的降解能力不同，噴施單一菌株后葉組淀粉的降解量最高可達16.6%（JC12），而噴施復配菌株后葉組淀粉的降解量最高為13.0%（JC01）。說明在復配條件下，菌株對葉組中淀粉的降解能力并未疊加，而是由于微生物的競爭性生長，復配菌株對淀粉的降解能力有所降低。

對水溶性糖而言，與對照相比，除試驗組JC01外，其余各試驗組的蔗糖含量均較對照葉組有顯著降低；對于葡萄糖而言，單一菌株比復配菌株的降低效果明顯；果糖含量均顯著降低，且不同菌株處理間差異明顯。水溶性糖含量的變化趨勢與淀粉的變化趨勢類似，即單一菌株作用下葉組蔗糖、葡萄糖和果糖含量的降幅均高于復配菌株。一般而言，微生物分解淀粉產(chǎn)生葡萄糖，而后進入糖代謝途徑。由于蔗糖、葡萄糖和果糖都是易被微生物利用的碳源，3種微生物能夠代謝這些水溶性糖，因而噴施菌株后葉組中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量呈下降趨勢。此外，對葉組而言，糖類與氨基酸的棕色化反應也會導致水溶性糖含量降低。

2.2 卷煙葉組含氮化合物的變化

2.2.1 總氮、可溶性蛋白質(zhì)、總植物堿和總揮發(fā)堿發(fā)酵后卷煙葉組的總氮、可溶性蛋白質(zhì)、總植物堿和總揮發(fā)堿如表3所示。由表3可知，用單一菌株和復配菌株（JC01）發(fā)酵時，卷煙葉組總氮含量顯著升高，但復配菌株的施加量較?。↗C02）時，與對照葉組之間差異不顯著。用芽孢桿菌發(fā)酵（JC11和JC12）后卷煙葉組總氮含量增幅略低于酵母菌發(fā)酵（JC10）。用復配菌株對卷煙葉組進行發(fā)酵時，較大施加量試驗組（JC01）葉組的總氮含量增幅顯著高于較小施加量試驗組（JC02），表明葉組總氮含量的升高與復配菌株的施加量密切相關(guān)。單一酵母菌試驗組（JC10）與復配菌株試驗組（JC01）葉組總氮含量之間差異不顯著，表明酵母菌在使葉組總氮升高的過程中起主導作用。一般而言，在煙葉發(fā)酵過程中，其總氮含量會下降［22-24］，但本研究中總氮含量有所升高，這與所用菌株及施加量密切相關(guān)［25-26］，也與文獻［9］中的研究結(jié)果一致。

表2 卷煙葉組淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量①（mg·g-1）

表3 卷煙葉組含氮化合物含量

兩種芽孢桿菌菌株（JC11和JC12）均使葉組可溶性蛋白質(zhì)顯著降低，最大可降解3.47%的蛋白質(zhì)（JC11），兩株芽孢桿菌降解葉組蛋白質(zhì)的能力無明顯差異。酵母菌（JC10）不能降解葉組的可溶性蛋白質(zhì)，反而使其略有上升。用復配菌株發(fā)酵后，葉組可溶性蛋白質(zhì)顯著降低，且復配菌株施加量越大，可溶性蛋白質(zhì)的降解量也越大，最大可達3.83%（JC01）。綜上可知，兩株芽孢桿菌在降解葉組可溶性蛋白質(zhì)方面起關(guān)鍵作用。一般而言，蛋白質(zhì)含量過高是導致煙草品質(zhì)下降的主要原因之一［5］，因而降低葉組蛋白質(zhì)含量可使卷煙的感官品質(zhì)得到改善。

植物堿是植物的代謝產(chǎn)物，常以無機酸或有機酸鹽形式存在，與煙氣感官品質(zhì)密切相關(guān)，其主要成分煙堿的含量與感官指標煙氣濃度顯著正相關(guān)［26］。由表3可知，與對照葉組相比，用兩株芽孢桿菌發(fā)酵（JC11和JC12）后，葉組總植物堿含量均顯著升高，而用酵母菌發(fā)酵（JC10）后，葉組總植物堿含量與對照葉組的差異不顯著。用復配菌株發(fā)酵時，在施加量較小（JC02）條件下，葉組總植物堿含量升高，而在施加量較大（JC01）條件下，葉組總植物堿含量與對照葉組無明顯差異，但復配菌株施加量較小時，葉組的總植物堿含量升高。對總揮發(fā)堿而言，單一菌株和復配菌株發(fā)酵均使其含量升高，且在單一菌株作用下，總揮發(fā)堿含量的增幅略高于復配菌株；復配菌株的施加量越大，總揮發(fā)堿含量增幅也越大。

2.2.2 氨基酸

發(fā)酵后卷煙葉組的氨基酸含量如表4所示。由表4可知，與對照葉組相比，用單一菌株和復配菌株發(fā)酵后，微生物分解可溶性蛋白質(zhì)（表3），使氨基酸總量有不同程度上升，僅LBT1.0013菌株發(fā)酵（JC12）后氨基酸總量略有下降。其中，脯氨酸含量最高，占氨基酸總量的85%左右。在微生物分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基酸中，一部分會供給其生長繁殖的需要。對于葉組而言，分解產(chǎn)生的氨基酸可與還原糖形成棕色化反應產(chǎn)物，從而有利于葉組感官品質(zhì)的改善。此外，氨基酸還參與煙草中糖類等物質(zhì)的代謝過程，生成多種化合物（包括生物堿）的前體物。

表4 卷煙葉組氨基酸含量（mg·g-1）

2.3 卷煙葉組有機酸含量的變化

發(fā)酵后卷煙葉組的草酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸含量如表5所示。由表5可知，與對照葉組相比：①用芽孢桿菌發(fā)酵（JC11和JC12）后，葉組草酸含量顯著升高，而用酵母菌發(fā)酵（JC10）后，葉組草酸含量與對照葉組差異不顯著；用復配菌株發(fā)酵后，葉組草酸含量顯著降低，且施加量越大，降幅越大。②單一菌株使葉組蘋果酸含量顯著升高，但復配菌株使葉組蘋果酸含量下降，且隨著復配菌株施加量的降低蘋果酸含量降幅增大。③用單一菌株發(fā)酵后，葉組檸檬酸含量顯著升高，但用復配菌株發(fā)酵后，檸檬酸含量在菌株施加量較大（JC01）時降低，在菌株施加量較小時（JC02）升高。④用單一菌株發(fā)酵后，葉組琥珀酸含量降低，而用復配菌株發(fā)酵后，琥珀酸含量的變化與檸檬酸類似，即在菌株施加量較大（JC01）時降低，施加量較小（JC02）時升高。⑤葉組乳酸含量在單一菌株作用下顯著升高，用復配菌株發(fā)酵時，在菌株施加量較大時（JC01）乳酸含量降低，施加量較?。↗C02）時則顯著升高。綜合來看，單一菌株使葉組有機酸總量升高，而復配菌株在施加量較大（JC01）時使葉組有機酸總量降低，在施加量較?。↗C02）時使其顯著升高。可見，單一菌株代謝產(chǎn)生有機酸使葉組中有機酸含量升高，而用復配菌株發(fā)酵時，葉組有機酸的變化與施加量密切相關(guān)。

表5 發(fā)酵后卷煙葉組有機酸含量（mg·g-1）

有機酸及其衍生物是煙草中主要香味成分之一，直接影響煙草及其制品的感官品質(zhì)。非揮發(fā)性酸可以調(diào)節(jié)煙氣pH，改善吸味使其變得醇和，還可以改善煙氣濃度。蘋果酸與煙葉品質(zhì)正相關(guān)，可以增加煙氣酸性，改進煙氣特征，使煙氣吸味平和。草酸和檸檬酸含量一般與煙葉品質(zhì)負相關(guān)，檸檬酸含量較高時烤煙吸味變差［27］。用復配菌株發(fā)酵（JC01）后，葉組草酸、檸檬酸和琥珀酸含量顯著降低，而蘋果酸和乳酸含量變化不顯著，總體上降低了對煙草吸味有不利影響的有機酸含量，有利于改善葉組的感官品質(zhì)。

2.4 卷煙葉組石油醚提取物含量的變化

煙草石油醚提取物與煙草香氣量有關(guān)，是影響烤煙感官品質(zhì)的重要因素之一，其含量較高時煙草外觀和吸味均較好。煙草石油醚提取物中主要成分為芳香油、樹脂、色素、醛、蠟質(zhì)、游離脂肪酸、脂肪和精油等，這些物質(zhì)是煙草香氣的重要來源，有些是香氣的前體物質(zhì)，有些能夠直接進入煙氣［28］。發(fā)酵后卷煙葉組的石油醚提取物含量如表6所示。

由表6可知，用芽孢桿菌LBT1.0007（JC11）和LBT1.0013（JC12）發(fā)酵對葉組石油醚提取物含量的增加沒有貢獻，甚至會使其含量降低（JC11）；但酵母菌LBT1.0038（JC10）則表現(xiàn)出較強的生香作用，可以明顯增加葉組石油醚提取物含量。在復配菌株施加量較大的情況下，葉組石油醚提取物含量顯著升高，表明隨著復配菌株施加量的增大，發(fā)酵后葉組中香氣物質(zhì)的生成量也增大，從而使葉組的吸食品質(zhì)得到明顯改善。

表6 發(fā)酵后卷煙葉組石油醚提取物含量

3 結(jié)論

在前期研究的基礎(chǔ)上，探討了單一菌株、復配菌株和不同復配菌株施加量對“好貓（天賦）”卷煙葉組主要化學成分的影響，結(jié)果表明：單一菌株對葉組各化學成分的影響與菌株有密切關(guān)系，芽孢桿菌在降解淀粉和蛋白質(zhì)方面起關(guān)鍵作用，而酵母菌對總氮和石油醚提取物的貢獻更大。當菌株復配后，并未呈現(xiàn)單一菌株對葉組化學成分影響的疊加效應，相反，在草酸等有機酸的變化上甚至呈現(xiàn)出完全相反的趨勢。復配菌株的施加量不同時，其對葉組化學成分的影響也存在顯著差異。可見，單一微生物和復配的微生物對卷煙葉組化學成分的影響十分復雜，需要進一步研究。

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責任編輯 洪廣峰

Effects of Single and Mixed Culture Solid State Fermentation on Main Chemical Components in Cigarette Blend

WANG Ying*1,2,MA Lingling*1,Lü Xin**1,ZHAO Dexue2,and HUANG Zhongbo2
1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,Shaanxi,China
2.China Tobacco Shaanxi Industrial Co.,Ltd.,Xi’an 710065,China

In order to study the effects of single bacterium strain and mixed strains on the chemical components in a cigarette blend,the influences of three strains（Saccharomyces sp.LBT1.0038,Bacillus sp. LBT1.0007 and LBT1.0003）on the carbohydrates,nitrogenous compounds,organic acids,amino acids and petroleum ether extract in a cigarette blend during solid state fermentation were investigated.The results showed that:comparing with the control,the content of starch in a cigarette blend significantly decreased and that of total water soluble sugar decreased;total nitrogen content did not change significantly,while protein content decreased and total content of amino acids increased after fermentation with single strain or mixed strains.The total content of organic acids in a cigarette blend increased after fermentation with single strain or mixed strains at a low application rate.The content of petroleum ether extract increasedsignificantly after fermentation with mixed strains.Both single and mixed strains affected the main chemical components in a cigarette blend,however,mixed strains did not present additive effects.Bacillus played an important role in the degradation of starch and protein,while Saccharomyces imparted significant effects on the total nitrogen and petroleum ether extract.

Microorganism；Strain；Cigarette blend；Solid state fermentation；Chemical component

TS444

A

1002-0861（2015）11-0047-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151109

2014-10-09

2015-06-26

陜西中煙工業(yè)有限責任公司重點項目“煙葉生物發(fā)酵增香技術(shù)研究及工業(yè)化應用”（No.047）。

王穎（1986—），女，碩士，助理工程師，主要從事煙草微生物生物技術(shù)研究。E-mail:ying45855117@163.com；*共同第一作者：馬玲玲（1986—），女，在讀碩士研究生，研究方向:煙草微生物生物技術(shù)。E-mail:345429831@qq. com；**

呂欣，E-mail:xinlu@nwsuaf.edu.cn

王穎，馬玲玲，呂欣，等.單一和復配微生物固態(tài)發(fā)酵對卷煙葉組主要化學成分的影響［J］.煙草科技，2015，48（11）：47-52.

WANG Ying，MA Lingling，Lü Xin，et al.Effects of single and mixed culture solid state fermentation on main chemical components in cigarette blend［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：47-52.