李偉，江翱，吳輝

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

主要組織相容性復(fù)合體(MHC)在機體獲得性免疫中具有重要作用[1]。MHC I 類和II 類分子分別負責(zé)內(nèi)、外源性抗原的加工和呈遞[2]。MHC I 類分子是由α 鏈和β 鏈(由β2 微球蛋白編碼)組成的異二聚體。經(jīng)典的MHC Iα 分子包含連接肽、跨膜區(qū)、胞質(zhì)區(qū)和胞外區(qū)等結(jié)構(gòu)域。MHC 分子不僅在群體內(nèi)存在著大量等位基因，而且等位基因間也存在較多變異[3]。II 類分子的多態(tài)性主要集中于外顯子2，而I 類分子的多態(tài)性主要集中于外顯子2 和外顯子3[4]。這些區(qū)域包含眾多抗原結(jié)合位點(PBR)。PBR位點的氨基酸發(fā)生變異會極大地影響MHC 識別病原并呈遞給T 細胞受體的能力[5]。MHC 分子的多態(tài)性和哺乳動物、家禽及魚類的抗病性密切相關(guān)[6–8]。MHC 作為用分子標記輔助育種的重要候選基因倍受重視。近年來有多種經(jīng)濟魚類的MHC 分子被陸續(xù)克隆[9–15]，魚類MHC Iα 基因的多態(tài)性研究已較為深入[16–18]。黃鱔MHC IIB 基因具有較豐富的多態(tài)性[4]，但關(guān)于其MHC Iα 基因的研究尚少。

黃鱔是一種重要的淡水養(yǎng)殖魚類，具有很高的食用和藥用價值?？寺『桶l(fā)掘具有重要開發(fā)潛力的抗病基因，并應(yīng)用于分子標記輔助育種對黃鱔的健康養(yǎng)殖具有重要意義。筆者克隆黃鱔MHC Iα 基因的全長cDNA 序列，探究其基因結(jié)構(gòu)，分析該基因的組織表達特異性和病原菌感染對基因表達的影響，探討黃鱔MHC Iα 基因的多態(tài)性，以期探明MHC I 類分子多態(tài)性與魚體抗病力的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚及病原菌感染

健康鱔魚約200 條，每條質(zhì)量60～70g，均購買于市場。室溫條件下，于水箱中暫養(yǎng)1 周后提取總RNA 和進行病原菌感染試驗。取心臟、肝臟、脾臟、胃、腎臟、血細胞、皮膚、腸、肌肉和腦等10 種組織，在液氮中速凍后提取總RNA。

細菌感染試驗按文獻[4]報道的方法進行。病原細菌Aeromonas hydrohilia 在液體LB 中 28℃培養(yǎng)到對數(shù)生長期后，4 500 r/min 離心收集，用滅菌生理鹽水(0.9%)將菌液稀釋至約2.2×107CFU/mL。隨機取45 尾魚用MS222 處理麻醉后進行腹腔注射。每條魚注射20 μL。對照魚注射生理鹽水。分別在感染后4、12、24、48、72 h 隨機選3個個體，取其肝臟、脾臟和腎臟3 種組織液氮速凍后提取總RNA。

1.2 DNA 的提取和cDNA 的合成

黃鱔肝臟DNA提取按照DNA分離試劑盒說明書進行。各組織總RNA 提取按照Trizol 試劑說明書進行。cDNA 合成按照PrimeScript RT regent 試劑盒說明書進行。

1.3 黃鱔MHC Iα 基因的克隆

根據(jù)已報道的魚類MHC Iα 基因序列，設(shè)計了一對簡并引物de–IA–F(5′–CAAACTTYCCAGAGT TTGT–3′)和de–IA–FR(5′–CCAGAGAGCTGRAAC ACACA–3′)，用來擴增黃鱔MHC Iα 基因的cDNA片段。根據(jù)上述cDNA 片段設(shè)計基因特異性引物IA–GSP5(5′–TGGACACCTCCACTTTGGTTGAAG CGC–3′)和IA–GSP3(5′–CCCAACAACGATGGGAC CTTCCAG–3′)，分別用于5′和3′ RACE 擴增。RACE擴增按照Smart RACE cDNA 擴增試劑盒說明書進行。Touchdown 擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，70℃退火45 s，72℃延伸2min，5個循環(huán)；94℃預(yù)變性1min，65℃退火50 s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；延伸10min。

PCR 產(chǎn)物回收、純化后，連接至pMD–19T 載體，克隆至Top10 感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行序列測定。根據(jù)cDNA 全長設(shè)計特異性引物，分離黃鱔MHC Iα 基因的內(nèi)含子，將各序列拼接后得到gDNA 結(jié)構(gòu)。

1.4 序列分析

利用網(wǎng)站https://www.predictprotein.org/對黃鱔MHC Iα 基因推斷的氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。保守結(jié)構(gòu)利用在線網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure 進行分析。

1.5 黃鱔MHC Iα 基因的表達分析

采用熒光定量PCR 技術(shù)，檢測MHC Iα組織表達特異性和病原菌感染對該基因表達的影響。以不添加模板的反應(yīng)作為空白對照，以β–actin 的表達作為內(nèi)參。設(shè)計的actin 引物為sense(5′–GCTGTGCT GTCCCTGTA–3′)和antisense(5′–GAGTAGCCACG CTCTGTC–3′)。設(shè)計的基因特異性引物為RT–F (5′–CAGATGTGATGGAGATTGTGTG–3′)和 RT–R (5′–CACCTACATTTGCTCCACTAC–3′)。熒光定量PCR 在7 500 RT–PCR 系統(tǒng)(ABI)上進行。20 μL 反應(yīng)體系中包含1 μL 模板，10 μL SYBR Premix Ex Taq，0.4 μL 引物，7.8 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性30 s，54℃退火25 s，72℃延伸1min，40個循環(huán)。

1.6 黃鱔MHC Iα 基因外顯子3 的多態(tài)性分析

利用引物IA–e3–F(5′–CTCAGGTGTCCACDT TTTACAG–3′)和IA–e3–R(5′–CATACCTGTTCTCA GCAGAGAGCT–3′)進行外顯子3 多態(tài)性分析。42個個體被用來檢測多態(tài)性。每個個體測定其5～7個陽性克隆的序列。等位基因按照文獻[19]的規(guī)則進行命名；PBR 位點的確定根據(jù)文獻[20]的規(guī)則進行。利用MEGA 4.0 軟件分析變異位點，運用Poisson- corrected 算法計算等位基因氨基酸間的遺傳距離。同義替代率(dS)和非同義替代率(dN)按照MEGA4.0中的Nei–Gojobori 算法進行，用Jukes–Cantor 算法進行校正。P 值和標準誤差的確定通過1 000次重復(fù)抽樣支持率的Z 檢驗獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔MHC Iα 基因的序列分析

黃鱔MHC Iα 基因全長5 037 bp，5′UTR 長78 bp，3′UTR 長600 bp，編碼1 條350個氨基酸的多肽鏈。其gDNA 序列包括4個外顯子和3個內(nèi)含子；內(nèi)含子1 長1 440 bp，內(nèi)含子2 長1 147 bp，內(nèi)含子3 長719 bp；連接肽(CP)、跨膜區(qū)(TM)、胞質(zhì)區(qū)(CT)之間沒有內(nèi)含子序列存在(圖1)。

圖1 黃鱔MHC Iα 基因的結(jié)構(gòu)及其推斷的氨基酸序列 Fig.1 Genomic structure of swamp eel MHC Iα and deduced amino acid sequence

2.2 黃鱔MHC Iα 基因的表達

黃鱔MHC Iα 基因在各組織的表達結(jié)果表明：健康黃鱔的肝臟等10 種組織MHC Iα 基因表達量存在著很大差異，血細胞的表達量最高，肝臟、心臟、脾臟和胃中的表達量中等，而皮膚、腦、肌肉、腎臟和小腸中的表達量較低(圖2)。病原細菌感染會顯著影響肝臟、脾臟和腎臟中MHC Iα 基因的表達。感染后4 h 內(nèi)肝臟、脾臟和腎臟中MHC Iα 基因的表達量基本保持不變。4 h 后腎臟中的基因表達量急劇上升，24 h 達到峰值，然后逐漸下降(圖3)；肝臟中的表達在感染4 h 后呈下降趨勢，72 h 后有所恢復(fù)(圖4)。感染4 h 后脾臟中MHC Iα 基因的表達量先下降，24 h恢復(fù)至正常水平后又下降，呈波動趨勢(圖5)。

圖2 黃鱔MHC Iα 基因在不同組織中的相對表達量 Fig.2 Relative expression analysis of swamp eel MHC Iαgene in different tissues

圖 3 病原菌感染后腎臟MHC Iα 基因的相對表達量 Fig. 3 Relative expression analysis of MHC Iαgene in kidney after infection with A. hydrophilia

圖4 病原菌感染后肝臟MHC Iα 基因的相對表達量 Fig.4 Relative expression analysis of MHC Iαgene in liver after infection with A. hydrophilia

圖5 病原菌感染后脾臟MHC Iα 基因的相對表達量 Fig. 5 Relative expression analysis of MHC Iαgene in spleen after infection with A. hydrophilia

2.3 黃鱔MHC Iα 基因的多態(tài)性

42個健康個體共得到有效等位基因50個，每個個體包含1～6個等位基因。據(jù)此推測，黃鱔基因組上可能至少含有3個MHC Iα 基因座位。分析等位基因PBR 位點和非PBR 位點的遺傳變異后發(fā)現(xiàn)：PBR 位點氨基酸水平的平均遺傳距離為0.393；非PBR 位點氨基酸水平的平均遺傳距離為0.178。各等位基因的PBR 位點和非PBR 的同義替代率( dS) 和非同義替代率( dN)計算結(jié)果表明：無論是PBR 位點還是非PBR 位點，其dN/dS均大于1。采用單尾的Z 檢驗進行正選擇(dN＞dS) 檢驗，P 值＜0.05，說明黃鱔MHC Iα 基因在進化過程中受到正向選擇的影響(表1)。

表1 等位基因間的遺傳距離及同義替代率與非同義替代率在外顯子3 的分布 Table 1 Pairwisegenetic distance and condon–based evolutionary divergence in all sites and PBR

3 結(jié)論與討論

通過同源克隆，結(jié)合RACE 技術(shù)，克隆了黃鱔MHC Iα 基因。經(jīng)序列分析，發(fā)現(xiàn)黃鱔MHC Iα 基因是“4 外顯子–3 內(nèi)含子”結(jié)構(gòu)。這與其他物種的MHC Iα 基因結(jié)構(gòu)不同[15，21–24]。黃鱔的MHC Iα 基因在10 種被檢測組織里的表達量存在著顯著差異；病原細菌A. hydrophilia 感染可以顯著影響肝臟、脾臟和小腸等組織里MHC Iα 基因的表達水平，這與許多魚類MHC 分子的研究報道[4,10—11,14–15,25]相似。黃鱔MHC Iα 基因具有豐富的多態(tài)性，50個不同的等位基因間非同義替代率(dN)與同義替代率(dS)的比值大于1，差異達到了顯著水平(P＜0.05)，說明黃鱔MHC Iα 基因在進化過程中受到正向選擇的影響[12,26]。

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