王汗成　田豐偉　翟齊嘯等

摘要 采用新鮮濃縮濕菌體、冷凍干燥菌粉和海藻酸鈉微膠囊包埋的不同加工方式，將植物乳桿菌CCFM8661作為添加劑加入到顆粒飼料中，進(jìn)行混合、制粒試驗(yàn)，探究其對益生菌活性的影響。結(jié)果表明，混合操作對3種不同益生菌添加方式下的活性影響不顯著，而制粒操作后新鮮濃縮濕菌體組存活率為5.98%，凍干菌粉組存活率為2.56%，海藻酸鈉包埋益生菌組存活率為24.01%。將3種不同益生菌添加方式的飼料與制粒后進(jìn)行益生菌噴涂的飼料在4 ℃和室溫（25 ℃）條件下進(jìn)行2個月貯存試驗(yàn)。試驗(yàn)期間內(nèi)各組在4 ℃下益生菌活性較為穩(wěn)定，25 ℃條件下各組活性均有下降，海藻酸鈉微膠囊組益生菌活性下降速度顯著低于其他3組。這說明海藻酸鈉微膠囊在制粒和后期貯存中顯著保護(hù)了益生菌的活性。

關(guān)鍵詞 植物乳桿菌；顆粒飼料；加工；貯存；活性

中圖分類號 S963.72 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-154-05

Study of Tilapia Diet Pellet Containing Probiotic on Processing Methods and Storage Activity

WANG Hancheng， TIAN Fengwei*， ZHAI Qixiao et al

（School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi， Jiangsu 214122）

Abstract Three processing methods， fresh concentrated bacterial， freeze dried bacterial powder and sodium alginate microcapsules were applied to add Lactobacillus plantarum CCFM8661 as feed additives to the tilapia diet pellet to explore how unit operations， the mixing and pelletization， influence the probiotic activity. The mixing has no obvious effects on the probiotic activity among three processing methods， however， the pelletization does. The survival rate of the probiotic is 5.98% through the fresh concentrated bacterial method after the pelletization， and that through the freeze dried bacterial method is 2.56%， and through the sodium alginate microcapsules method is 24.01%. Then different feeds made through the three methods and pelleted feed using probiotic spray coating were applied to take the storage experiment in 4 ℃ condition， and 25 ℃ for 2 months. The result indicates that all groups showed a steady probiotic activity in the 4 ℃ during the experiment. And in the 25 ℃， although the sodium alginate group showed a same decrease tendency， the rate of descent is significantly lower than other groups. The result indicated that the sodium alginate microcapsules protect the probiotic in the pelletization and storage.

Key words Lactobacillus plantarum； Diet pellet； Processing； Storage； Activity

乳酸菌是一類利用糖類進(jìn)行代謝并產(chǎn)生乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性菌的總稱，包括乳桿菌、乳球菌和雙歧桿菌在內(nèi)的23個屬。乳酸菌廣泛應(yīng)用于食品、飼料和發(fā)酵領(lǐng)域，被認(rèn)為是安全的食品微生物，是益生菌的主要來源[1]。根據(jù)不同的益生菌菌屬和菌株特性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了乳酸菌在維持腸道菌群平衡、抑制致病菌[2]、增強(qiáng)免疫力、降低膽固醇[3]以及在緩解氧化[4]和重金屬中毒[5-6]等方面產(chǎn)生了重要的作用。

隨著益生菌的開發(fā)和研究，越來越多的菌株應(yīng)用在水產(chǎn)行業(yè)，將益生菌作為飼料添加劑，在腸道內(nèi)通過調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的作用，拮抗致病菌，可以有效防治疾病，提高免疫力[7-9]，促進(jìn)進(jìn)食和生長[10-11]。將乳酸菌作為飼料添加劑在吉富羅非魚[12]、奧尼羅非魚[13-14]、草魚[15]、牙鲆稚魚[16]和南亞野鯪[7]等中應(yīng)用，取得了顯著的效果。研究表明，乳酸菌能促進(jìn)水產(chǎn)動物的孵化，提高幼魚的存活率[17]，并對斑馬魚的骨骼發(fā)育和性別分化產(chǎn)生促進(jìn)作用[18]。然而，將乳酸菌應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)中，必須要經(jīng)過高溫高壓環(huán)境的制粒加工且菌體必須要在保存期內(nèi)保持活力才能在最終飼喂中發(fā)揮其作用。一般的乳酸菌并不能夠耐受制粒加工的高溫，但不同乳酸菌對熱的耐受性不同[19]。在混合和壓粒的過程中，機(jī)械擠壓與高溫使蛋白質(zhì)變性，酶和微生物失活。失活的程度與溫度、壓力、水分、微生物的特性和保護(hù)劑的性質(zhì)有關(guān)[20]。大多數(shù)乳酸菌在達(dá)到80 ℃時存活率較低，僅有幾種芽孢桿菌能夠耐受此加工溫度[21]。因此，在商業(yè)中使用乳酸菌，乳酸菌的抗逆性研究是非常值得關(guān)注的問題[19]。

研究表明，嗜溫微生物在脅迫條件下能夠提高微生物的抗性[22]，冷脅迫和熱脅迫之間可能存在交叉保護(hù)機(jī)制，植物乳桿菌在進(jìn)行冷脅迫處理后會誘導(dǎo)熱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)[23-24]。對菌體進(jìn)行冷凍干燥后，能抑制菌體的生長代謝，使菌體進(jìn)入休眠狀態(tài)，能夠更好地應(yīng)對外界的不良環(huán)境[25]。采用微膠囊以及雙層包埋的手段可以有效地保護(hù)乳酸菌，減少來自外界惡劣環(huán)境的影響，延長益生菌活力保持時間[26]。研究發(fā)現(xiàn)，采用海藻酸鈉[27]、蛋白質(zhì)[28]、膠體[29-31]和淀粉[32]多糖類等壁材通過噴霧干燥、擠壓和乳化的不同方式包埋乳酸菌可以顯著提高乳酸菌的熱穩(wěn)定性和貯存期[33]。海藻酸鈉對生物無毒性，凝膠機(jī)械強(qiáng)度和耐生物分解性良好，是較為合適的固定化細(xì)胞載體[34]。通過制粒之后表面噴涂的方式可以有效避免益生菌遭受惡劣的加工環(huán)境[35]。此外，不同的貯存溫度與貯存方式對乳酸菌的活性保持也有較大的影響[36]。但是，將益生菌包埋和微膠囊技術(shù)應(yīng)用于飼料加工卻鮮有報道。

植物乳桿菌CCFM8661是江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)篩選得到的1株在緩解鉛暴露誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和毒性作用[6]的專利菌株。筆者以該菌株作為羅非魚顆粒飼料添加劑，通過對其以新鮮濕菌體、凍干菌粉和海藻酸鈉單層包埋以及制粒后噴涂加工方式，制備成活菌含量為108 CFU/g的益生菌飼料，探究混合、制粒和貯存溫度與時間對其活力的影響，旨在為將植物乳桿菌CCFM8661應(yīng)用于飼料加工探索新的道路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株。試驗(yàn)所用菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum CCFM8661），由江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室自行篩選分離。

1.1.2 培養(yǎng)基。乳酸菌MRS肉湯液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，吐溫80 1 ml，MgSO4·7H2O 0.1 g，MnSO4·H2O 0.5 g，檸檬酸二銨2 g，K2HPO4 2 g，去離子水1 000 ml，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.2～6.4。固體培養(yǎng)基加入18～20 g瓊脂，于115 ℃下高溫滅菌20 min。

1.1.3 飼料原料。飼料原料包括大豆粕、米糠、面粉、魚粉、棉籽粕、菜籽粕、豆油、預(yù)混料（礦物質(zhì)與維生素）。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備。AUTOCLAVE MLS3750 型滅菌鍋，為三洋電器股份有限公司產(chǎn)品；EL204 型電子天平，為梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；LABCON7948030型冷凍干燥機(jī)，為美國Labcon有限公司產(chǎn)品；J6型大容量冷凍離心機(jī)，為美國貝克曼公司產(chǎn)品；搖擺式高速粉碎儀，為溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；SKJ120型小型顆粒飼料機(jī)，為濟(jì)南牧龍機(jī)械有限公司產(chǎn)品；面包攪拌機(jī)，為新麥機(jī)械（無錫）有限公司產(chǎn)品；垂直流超凈工作臺，為上海智誠分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；BagMixer400CC型數(shù)顯拍打式均質(zhì)儀，為法國Interscience公司產(chǎn)品；GHP9160 型恒溫培養(yǎng)箱，為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng)。從菌種庫中取出菌株接入乳酸菌MRS肉湯液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，37 ℃下培養(yǎng)18～24 h，按照2%接種量接種第2代、第3代，以2%接種量擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 生長曲線的測定。將經(jīng)2次傳代培養(yǎng)18 h至對數(shù)期后期的新鮮培養(yǎng)物按0.1%（v/v）接種量接入MRS培養(yǎng)基中，每隔2 h取樣，測定培養(yǎng)物在620 nm波長處的OD620 nm值；同時根據(jù)需要，對培養(yǎng)物進(jìn)行10倍系列稀釋，并采用標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法對培養(yǎng)物中的活菌數(shù)量進(jìn)行計數(shù)[37]。

1.2.3 飼料制作流程。飼料制作流程如圖1所示。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年

1.2.4 新鮮濕菌體的制備。將菌體活化后，37 ℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至穩(wěn)定期，4 ℃條件下6 000 r/min離心10 min，棄去上清，菌泥用60 mmol/L無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.5）洗滌2次后重懸于無菌PBS中（按照PBS/原菌液=1∶100計算），置于4 ℃條件下備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.5 凍干菌粉的制備。培養(yǎng)與洗滌條件同上，重懸于無菌PBS中（按照PBS/原菌液=1∶10比例計算），再加入同等體積的凍干保護(hù)劑海藻糖，使最終濃度為10%。放入平板中覆蓋保鮮膜，置于-70 ℃中預(yù)凍4 h，將預(yù)凍好的菌體，放入Labconco冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，冷阱溫度為-50 ℃，真空度為4 Pa，時間為48 h。冷凍干燥結(jié)束后，樣品備用置于-20 ℃下備用。

1.2.6 海藻酸鈉微膠囊的制備[38-39]。新鮮濕菌體制備之后使用無菌生理鹽水重懸調(diào)整濃度，以體積比為1∶10與2%海藻酸鈉溶液充分混合，并加入0.4%的吐溫80，磁力攪拌器攪拌乳化15 min，使用壓力噴嘴噴入0.2 mol/L的CaCl2溶液中，固化15 min，用紗布過濾，生理鹽水沖洗3次，得到微膠囊。

1.2.7 制粒后噴涂乳酸菌飼料的制備。飼料制粒后，待冷卻，將無菌生理鹽水稀釋的濃縮新鮮菌液用壓力噴嘴均勻的噴入顆粒飼料中。

1.2.8 飼料加工對菌株存活的影響。按照一定的添加比例，將益生菌按照不同方式添加到無抗生素、無銅、無鋅的羅非魚飼料中，經(jīng)過混合機(jī)混合得到混合粉狀飼料，對粉狀飼料中的活菌含量進(jìn)行檢測；將混合后的粉狀飼料在制粒機(jī)中進(jìn)行制粒，制粒溫度為70 ℃，制粒結(jié)束后對顆粒飼料中的活菌含量進(jìn)行檢測。

1.2.9 飼料貯存過程對菌株存活的影響。將不同益生菌添加方式加工的粉狀飼料和顆粒飼料分別放于塑料自封袋中，分別存放于4和25 ℃條件下貯存2個月，每隔7 d對顆粒飼料進(jìn)行1次活菌取樣計數(shù)。

1.2.10 飼料加工過程的取樣方法。在混合機(jī)和制粒機(jī)出料口抽取樣本，每批試驗(yàn)抽取10個樣本，每個樣品的重量為100 g，考慮進(jìn)料時間、方位、深度的代表性。每個原始樣品充分混勻，采用四分法分取樣品。

1.2.11 飼料中活菌數(shù)的測定。以新鮮菌泥、凍干菌粉和后噴涂方式制作的飼料稱取樣品25 g，裝入盛有225 ml，0.85%無菌生理鹽水的無菌袋中，采用無菌均質(zhì)儀以8T/s，拍打10 min，充分混勻成樣品勻液，取少量液體進(jìn)行無菌梯度稀釋，分別吸取0.2 ml放入裝有凝固MRS瓊脂培養(yǎng)基的無菌平板中，用無菌涂布棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻，每個樣品3個重復(fù)，將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，選取30～300個菌落之間的平板進(jìn)行計數(shù)。以微膠囊方式制作的飼料稱取樣品25 g加入到無菌的0.06 mol/L的檸檬酸三鈉溶液225 ml中，37 ℃振蕩處理40 min，隨后按上述操作進(jìn)行計數(shù)。

1.2.12 混合前后益生菌存活率的計算。對益生菌飼料進(jìn)行活菌計數(shù)，所得結(jié)果乘以飼料重量，記為M。對添加入飼料前的菌液，菌粉和微膠囊進(jìn)行活菌計數(shù)，計算出活菌總數(shù)，記為M0。按照以下公式計算混合前后益生菌存活率：

存活率=M/M0×100%（1）

1.2.13 制粒前后益生菌存活率的計算。對制粒前后的飼料進(jìn)行活菌計數(shù)，分別記為W0和W。按照以下公式計算制粒前后益生菌存活率：

存活率=W/W0×100%（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 CCFM8661的生長曲線

選擇菌體在對數(shù)生長期末期，穩(wěn)定期前期進(jìn)行收菌。從圖2可以看出，植物乳桿菌CCFM8661菌體在約18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，進(jìn)入穩(wěn)定期的活菌數(shù)數(shù)量級在109。因此，對菌體培養(yǎng)18 h后進(jìn)行收菌處理。

2.2 混合對不同益生菌添加方式飼料益生菌活性的影響

對混合前后的活菌數(shù)進(jìn)行計數(shù)，計算出活菌總數(shù)，分別計算存活率為M1、M2、M3（表2）。利用PASW Statistics 18軟件進(jìn)行Oneway Anova分析，利用Tukey進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，各組間沒有顯著差異（P>0.05）。這說明混合單元操作對菌體的活性基本沒有影響。

2.3 制粒對不同益生菌添加方式飼料益生菌活性的影響

制粒單元操作對不同添加方式益生菌活性影響較大。由表3可知，對濃縮菌液添加方式和凍干菌粉添加方式的影響較大，其存活率分別降低到了6%和2.54%。采用海藻酸鈉進(jìn)行微膠囊處理后，其存活率顯著提升，達(dá)到24.01%，相比于另外2個組分別提高了4倍和9倍。這說明海藻酸鈉微膠囊能有效的保護(hù)益生菌在惡劣加工環(huán)境下存活。

2.4 顆粒飼料在4 ℃和25 ℃條件下貯存不同益生菌添加方式顆粒飼料中益生菌活性變化

在不同的貯存溫度條件下，益生菌活力變化出現(xiàn)了明顯的分化。從圖3～4可以看出，4 ℃條件下4組益生菌均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。在1個月時間內(nèi)4組的益生菌活性均能保持在同一數(shù)量級上。從圖4可以看出，2個月的貯存試驗(yàn)中，海藻酸鈉微膠囊組表現(xiàn)出了最好的穩(wěn)定性。在第8周時其活菌數(shù)仍然能夠保持在40%左右。其他3組的活菌數(shù)在第6周的時間開始出現(xiàn)較大程度降低，第8周時下降程度最大的是凍干菌粉添加組，其活菌的存活率下降到3.38%。其次為制粒后噴涂益生菌組，為8.16%。造成這種現(xiàn)象的原因可能是海藻酸鈉作為微膠囊包裹了乳酸菌，避免了與外界環(huán)境的接觸，較好地保護(hù)了益生菌的存活。凍干菌粉組，雖然菌體在凍干過程中進(jìn)入了休眠狀態(tài)，但是可能4 ℃環(huán)境并不適合其休眠的環(huán)境，導(dǎo)致其在此環(huán)境下死亡較多。

從圖5～6可以看出，在25 ℃條件下，幾乎所有組均表現(xiàn)出不適應(yīng)性。第5周，均未檢測到活菌數(shù)。除了海藻酸鈉微膠囊組外，其他組在第3周未檢測到活菌數(shù)。海藻酸鈉微膠囊組在前1個月內(nèi)的活菌數(shù)要顯著高于其他3個組（P<005）。制粒后噴涂益生菌組也表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性，第2周以后就檢測不到活菌數(shù)。

3 討論與結(jié)論

混合所產(chǎn)生的摩擦與熱能較小，對微生物及活性物質(zhì)的危害較小，其對本株植物乳桿菌的影響可以忽略不計，且各組間不存在顯著差異。李鑫等研究飼料混合對多種益生菌的影響發(fā)現(xiàn)，僅有嗜酸乳桿菌的存活率在95%以下，其他益生菌的存活率都接近100%，都能保持在較高水平[21]。

制粒是顆粒飼料加工過程中對微生物來說最為惡劣的一個單元操作，經(jīng)過壓力摩擦、產(chǎn)熱，甚至是蒸汽噴射，最高溫度甚至能達(dá)到100 ℃，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，有益微生物和酶制劑的性能受到嚴(yán)重破壞[20]。該試驗(yàn)中海藻酸鈉微膠囊與單獨(dú)添加益生菌相比顯著提高了制粒的益生菌存活率，但仍有一些益生菌死亡，單位益生菌菌液所能制作的合格成品飼料減少，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。王衛(wèi)國等[35]報道盡管可以將酶制劑、益生菌制成包膜型或微膠囊型，飼料熱加工過程中特別是擠壓膨化、擠壓膨脹、高溫調(diào)質(zhì)、制粒、烘干等加工過程中仍會造成大量損失。筆者嘗試避開了制粒的單元操作，使用了制粒后噴涂益生菌的加工方式，在加工成品飼料益生菌上節(jié)省了生產(chǎn)成本。

貯存溫度是影響益生菌活性及飼料貨架期的重要因素[36]，該研究結(jié)論也進(jìn)一步證實(shí)了此觀點(diǎn)。在4 ℃條件下貯存各個組在各個階段的飼料益生菌活性均顯著高于25 ℃（P<0.05）。在25 ℃條件下貯存制粒后噴涂益生菌的活性下降速度仍然很快，說明只是單純避開制粒操作而不考慮貯存問題也無法真正解決問題。在較高溫度下貯存，對益生菌添加劑進(jìn)行保護(hù)是必要措施，單純降低貯存溫度會大大增加成本。海藻酸鈉在乳酸菌包埋中是應(yīng)用廣泛的原料，張強(qiáng)等[27]研究發(fā)現(xiàn)，使用海藻酸鈉作為包埋劑研究嗜酸鏈球菌的包埋工藝并分析其生物活性，乳酸菌經(jīng)過海藻酸微膠囊包埋后其熱穩(wěn)定性和耐貯存穩(wěn)定性都顯著提高，為動物顆粒飼料的制作和運(yùn)輸貯存提供了科學(xué)依據(jù)。綜合分析，解決益生菌在顆粒飼料中的應(yīng)用需要從多個方面入手，制粒的條件要在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下相對的溫和，找到最優(yōu)化的保護(hù)益生菌的微膠囊壁材和包埋方式，在制粒和貯存中隔絕益生菌與外界環(huán)境，從而達(dá)到保護(hù)益生菌的目的，進(jìn)而能夠降低生產(chǎn)成本和延長益生菌飼料的貨架期。

筆者將植物乳桿菌CCFM8661作為魚飼料益生菌添加劑，采用新鮮菌液、凍干菌粉和海藻酸鈉微膠囊的不同加工工藝，進(jìn)行加工試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)混合對該株益生菌活性影響不大，海藻酸鈉微膠囊加工工藝能顯著提高益生菌在制粒過程中的存活率。聯(lián)合制粒后噴涂益生菌組分別在4和25 ℃條件下貯存2個月，發(fā)現(xiàn)4 ℃條件下貯存有利于保存益生菌活性，且海藻酸鈉微膠囊工藝能在4 ℃條件下保持更穩(wěn)定的活性，減緩益生菌在25 ℃條件下活力下降速度，保護(hù)益生菌的活性。

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