崔燦　王志蓮　郝敏等

[摘要] 目的 探討結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）及整合素β1（integrin β1）在壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）大鼠模型陰道前壁中的表達(dá)。 方法 將健康雌性SD大鼠24只隨機(jī)分為3組，A組大鼠作為對(duì)照組不做任何處理；B組大鼠僅行陰道擴(kuò)張；C組大鼠行陰道擴(kuò)張加雙側(cè)卵巢切除。于術(shù)后第4周測(cè)定最大膀胱容量（MBC）和腹壓漏尿點(diǎn)壓（ALPP），檢測(cè)壓力性尿失禁模型是否建立成功。建模成功4周后處死大鼠后取陰道前壁組織，行免疫組化染色方法和實(shí)時(shí)熒光定量TR-PCR技術(shù)檢測(cè)CTGF和整合素β1的表達(dá)。結(jié)果 尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)（MBC、ALPP）：B、C組較A組明顯降低，且各組之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CTGF mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)C組低于A組（P<0.05），A、B兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；C組整合素β1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯低于A、B組（P<0.05），且A、B兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 在SUI大鼠陰道前壁CTGF和整合素β1的低表達(dá)可能與壓力性尿失禁等盆底支持結(jié)構(gòu)的退行性病變的發(fā)生存在密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 壓力性尿失禁；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；整合素β1

[中圖分類(lèi)號(hào)] R694.54 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）11-0025-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of the connective tissue growth factor（CTGF） and integrin β1 in vaginal anterior wall of the model rats with stress urinary incontinence. Methods Twenty-four healthy female SD rats were randomly divided into three groups， group A rats as control group without any treatment；group B rats only with vaginal expansion；group C rats with vaginal expansion and bilateral ovaries removed. At postoperative four weeks to determine the maximum bladder capacity （MBC） and abdominal pressure leakage point pressure （ALPP）， to establish detection model for stress urinary incontinence. Modeling successfully executed in rats after four weeks after vaginal anterior wall tissue， immunohistochemical staining method and real-time fluorescent quantitative RT-PCR technique to detect the expression of CTGF and integrin β1. Results The urine flow dynamic detection （MBC， ALPP）： B and C group was significantly lower than group A， there were statistically significant differences（P<0.05）；CTGF mRNA and protein expression in group C was significantly lower than group A （P<0.05）， there were no statistical significance between group A and group B（P>0.05）；integrin β1 mRNA and protein in group C expression was lower than that in group A and B（P<0.05）， and differences between A and B were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The anterior wall vaginal CTGF in rats in SUI and low expression of integrin β1 may be related to stress urinary incontinence and other pelvic floor support structure there is a close relationship of the occurrence of degenerative diseases of the pelvic floor support degenerative diseases.

[Key words] Stress urinary incontinence； Connectivetissue growth factor； Integrin β1

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI） 定義為在無(wú)逼尿肌收縮的情況下，腹壓增高引起膀胱內(nèi)壓增高，超過(guò)尿道和括約肌產(chǎn)生的壓力，尿液自尿道外口漏出的現(xiàn)象[1]。威脅生命且嚴(yán)重影響到患者的心理、生理健康，同時(shí)會(huì)給社會(huì)造成一定程度的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盆底結(jié)締組織結(jié)構(gòu)改變或功能減弱的分子學(xué)機(jī)制是目前壓力性尿失禁研究的熱點(diǎn)[2]。近些年來(lái)對(duì)于SUI發(fā)病機(jī)制的研究越來(lái)越受到重視，研究表明[3]，在SUI患者盆底支持結(jié)構(gòu)中，膠原彈性蛋白含量的減少會(huì)導(dǎo)致支持組織彈性減弱，從而出現(xiàn)盆底的松弛，進(jìn)一步導(dǎo)致SUI。而結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connectivetissue growth factor，CTGF）可以刺激成纖維細(xì)胞增殖和分泌膠原，在纖維化性疾病創(chuàng)傷后瘢痕形成等方面有較多的研究，含β1亞單位的整合素主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的黏附，近年研究發(fā)現(xiàn)CTGF可以通過(guò)與整合素受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的活性。然而關(guān)于整合素β1在SUI發(fā)生發(fā)展機(jī)制的相關(guān)研究較為少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)的研究目的為檢測(cè)CTGF和整合素β1在壓力性尿失禁大鼠模型的陰道前壁中的表達(dá)，進(jìn)一步探究其在壓力性尿失禁發(fā)生機(jī)制中的作用，以期為壓力性尿失禁的預(yù)防、治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只健康雌性SD大鼠由山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供，體重220～250 g。隨機(jī)分三組，每組8只：A組不做任何處理；B組行陰道擴(kuò)張模擬難產(chǎn)；C組模擬難產(chǎn)加雙側(cè)卵巢切除。4周后經(jīng)檢測(cè)建模是否成功（尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)和噴嚏實(shí)驗(yàn)證實(shí) ），見(jiàn)表1。

1.2 標(biāo)本采集及處理

造模成功后常規(guī)喂養(yǎng)4周后將大鼠處死，取陰道前壁組織兩塊，約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，反復(fù)、多次用生理鹽水洗凈，一塊放入加有中性緩沖液的10%的甲醛液中固定，準(zhǔn)備行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。另一塊立即放入-80℃液氮中，以避免mRNA降解，待行實(shí)時(shí)熒光定量TR-PCR技術(shù)檢測(cè)。

1.3 試劑

羊抗兔CTGF、整合素β1和β-actin多克隆抗體（博奧森生物技術(shù)有限公司），辣根過(guò)氧化酶的山羊抗鼠二抗（購(gòu)于北京中杉金橋公司），試劑盒、RT-PCR盒及相關(guān)試劑（北京全式金生技術(shù)有限公司），引物（北京博大泰克生物技術(shù)公司）。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)CTGF及整合素β1蛋白的表達(dá)

采用SABC法進(jìn)行免疫組織細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果判定：細(xì)胞外基質(zhì)染為黃色或棕黃色為CTGF蛋白及β1整合素蛋白陽(yáng)性。操作步驟按免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用BI 2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)采集顯微鏡下圖像，隨機(jī)在每張免疫組化切片上選擇5個(gè)視野 （400倍），每個(gè)視野拍攝5張照片，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)（A）及細(xì)胞顯色程度（B）計(jì)算免疫組化評(píng)分（IHS），以其均值進(jìn)行比較[4]。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量TR-PCR

按照Trizol試劑使用說(shuō)明書(shū)提取總RNA，經(jīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物堿基序列見(jiàn)表2。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃預(yù)變性2 min，35個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min），72℃最后延伸5 min。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的原理，以β-actin基因mRNA的表達(dá)為內(nèi)對(duì)照，首先計(jì)算出各目的基因的CT值與β-actin內(nèi)參基因的CT值的差值，即ΔCT=CT（目的基因）-CT（β-actin），然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組各樣本的ΔCT值與對(duì)照組樣本的ΔCT值的差值，從而得到ΔΔCT值，即ΔΔCT=ΔCT（實(shí)驗(yàn)組）-CT（對(duì)照組），利用2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算，表示實(shí)驗(yàn)組測(cè)定基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組樣本基因的表達(dá)的變化倍數(shù)[5]，將2-ΔΔCTx±s作為最后的定量結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間正態(tài)分布采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t法；不滿足正態(tài)性和方差齊性則采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)CTGF、整合素β1蛋白的表達(dá)

見(jiàn)圖1、2及表3。鏡下3組陰道前壁標(biāo)本均可見(jiàn)CTGF蛋白及整合素β1蛋白表達(dá)于成纖維細(xì)胞胞漿。A組CTGF蛋白的等級(jí)資料免疫組化評(píng)分為（7.75±1.49）分，B組免疫組化評(píng)分為（6.25±1.91）分，C組免疫組化評(píng)分為（5.50±0.93）分，A組與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），A組明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），B組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；A、B、C三組整合素β1蛋白的免疫組化評(píng)分分別為（6.13±1.36）分、（5.00±1.07）分、（3.63±0.74）分，A組與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），C組明顯低于A、B兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 RT-PCR檢測(cè)CTGF mRNA及整合素β1 mRNA的表達(dá)

見(jiàn)表4。B組、C組CTGF mRNA的表達(dá)量均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但B組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；C組整合素β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于A組、B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但B組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

壓力性尿失禁有“社交癌”之稱(chēng)，嚴(yán)重地影響了女性的社交活動(dòng)，同時(shí)還可引發(fā)心理障礙，給家庭和國(guó)家醫(yī)療服務(wù)增加一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。由于分娩、手術(shù)等原因所造成得盆底組織損傷與女性SUI有直接的關(guān)系。

隨后Batmunkh等[6]在PDGF誘導(dǎo)下的人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)CTGF的分泌，并將其首次克隆出來(lái)。CTGF也稱(chēng)作CCN2，屬于即刻早期基因（CCN）家族的成員之一[7]，其編碼基因定位于6號(hào)染色體長(zhǎng)臂（6q23.1）上，是一種由349個(gè)氨基酸殘基組成的富含半胱氨酸的分泌性多肽[8]，分子量為36～38 kD[9]。CTGF的來(lái)源細(xì)胞種類(lèi)繁多，如胚胎細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等。CTGF在人類(lèi)心臟、胎盤(pán)、肺、肝臟及腎臟等多種組織器官中均有表達(dá)。在組織損傷修復(fù)、纖維化、潰瘍愈合及腫瘤發(fā)生等多種組織重建相關(guān)性疾病中，CTGF均起到重要作用[10，11]。Daniels等[12]研究證實(shí)在成纖維母細(xì)胞中，少量表達(dá)的CTGF可促進(jìn)膠原的收縮，控制基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs的作用，據(jù)此推測(cè)CTGF在SUI的發(fā)生發(fā)展中可能與盆底組織損傷后修復(fù)有關(guān)。目前利用脂肪源性干細(xì)胞（ADSC）增殖和分化為成纖維細(xì)胞來(lái)治療SUI，是盆底疾病領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[13，14]。有研究表明，在體外培養(yǎng)的大鼠脂肪干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CTGF刺激可以使各型膠原表達(dá)逐漸增加，并且隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在壓力性尿失禁大鼠模型陰道前壁組織中，陰道擴(kuò)張加雙側(cè)卵巢切除組的CTGF蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯低于正常組，但陰道擴(kuò)張組及陰道擴(kuò)張加雙側(cè)卵巢切除組CTGF的蛋白和mRNA水平的比較無(wú)明顯差異，提示在CTGF表達(dá)降低，可能減少刺激成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的分泌，從而影響盆底結(jié)締組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及完整性，可能是導(dǎo)致SUI發(fā)生的重要原因。

整合素β1是一類(lèi)近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的CTGF的細(xì)胞表面受體，CTGF可以直接與其細(xì)胞表面的整合素β1受體結(jié)合進(jìn)而啟動(dòng)下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮促進(jìn)纖維化的作用。有研究報(bào)道，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中，整合素β1發(fā)揮了調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附等功能。目前國(guó)內(nèi)外主要在心、肝及皮膚瘢痕等組織中對(duì)整合素β1進(jìn)行研究，其過(guò)度表達(dá)可以導(dǎo)致一些纖維化性或增生性的疾病發(fā)生，如肝硬化、肝纖維化等。但是目前在SUI方面的研究較少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在壓力性尿失禁大鼠模型陰道前壁組織中，陰道擴(kuò)張加雙側(cè)卵巢切除組的整合素β1蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯低于正常組及僅陰道擴(kuò)張組，提示在SUI的發(fā)生機(jī)制中，整合素β1表達(dá)的降低可能影響其作為受體與CTGF結(jié)合，將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步導(dǎo)致盆底結(jié)締組織損傷后的修復(fù)。

綜上所述，多種因素綜合作用下導(dǎo)致盆底結(jié)締組織中膠原含量的減少及其作用的發(fā)揮，最終可能造成SUI的發(fā)生。CTGF/整合素β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與SUI的發(fā)生機(jī)制的相關(guān)性研究，目前還在動(dòng)物組織學(xué)水平的實(shí)驗(yàn)階段，根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)論推測(cè)，有效地抑制該通路，可能會(huì)引起成纖維分泌膠原蛋白的減少，而導(dǎo)致SUI的發(fā)生。如果能以此通路的作用機(jī)制作為今后SUI發(fā)生的研究靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究二者下游啟動(dòng)哪些信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用，可能為SUI的預(yù)防、治療提供一定的理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Hunskaar S，Burgio K，Clark A，et al. Epedemiology of urinary andfecal incontinence and pelvic organ prolapsed[M]//Abrams P，Cardozo L，Khoury S，et al. Incontinence：3rd international consultation on incont inence[M]. Paris：Health Publication Ltd，2005：255-312.

[2] Koike Y，F(xiàn)uruta A，Suzuki Y，et al. Pathophysiology of urinary incontinence in murine models[J]. Int J Urol，2013，20（1）： 64-71.

[3] 曹冬，王建六. 盆底結(jié)締組織膠原代謝異常與壓力性尿失禁[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)（婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè)），2006，33（2）：89-91.

[4] Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al. Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors[J]. Cancer，2000，89：2637-2645.

[5] 朱蘭，郎景和，劉春燕，等. 我國(guó)成年女性尿失禁患病狀況的流行病學(xué)研究[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志，2009，44（10）：776-779.

[6] Batmunkh R，Nishioka Y，Aono Y，et al. CCN6 as a profibrotic mediator that stimulates the proliferation of lung fibroblasts via the integrin beta1/focal adhesion kinase pathway[J]. The journal of medical investigation， 2011，58（3-4）：188-196.

[7] Katsube K，Sakamoto K，Tamamura Y，et al. Role of CCN， a vertebrate specific gene family，indevelopment[J]. Dev Growth Differ，2009，51（1）：55-67.

[8] Riser BL，Najmabadi F，Perbal B，et al. CCN3 （NOV） is a negative regulator of CCN2（CTGF）and a novel endogenous inhibitor of the fibrotic pathway in an in vitro model of renal disease[J]. Am J Pathol，2009，174（5）：1725-1734.

[9] Hao S，Shen H，Hou Y，et al. tPA is a potent mitogen for renal interstitial fibroblasts：Role of beta1 integrin/focal adhesion kinase signaling[J]. The American Journal of Pathology， 2010，177（3）：1164-1175.

[10] An J，Zheng L，Xie S，et al. Down-regulation of focal adhesion kinase by short hairpin RNA increased apoptosis of rat hepatic stellate cells[J]. Acta Pathologica， Microbiologica，Etimmunologica Scandinavica，2011，119（6）：319-329.

[11] Liu Z，Zhou Y，Wu W. Effect of antisense oligonucleotides targeting focal adhesion kinase on the proliferation and activation of hepatic stellate cells[J]. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi，2008，25（2）：419-423.

[12] Daniels JT，Schultz GS，Blalock TD，et al. Mediation of transforming growth factor-beta（1）-stimulated matrix contraction by fibroblasts：A role for connective tissue growth factor in contractile scarring[J]. Am J Pathol，2003，163（5）：2043-2052.

[13] Nikolavasky D，Stangel-Wójcikiewicz K，Stec M，et al. Stem cell therapy：A future treatment of stress urinary incontinence[J]. Semin Reprod Med，2011，29（1）：61-70.

[14] Stangel-Wójcikiewicz K，Majka M，Basta A，et al. Adult stem cells therapy for urine incontinence in women[J]. Ginekol Pol，2010，81（5）：378-381.

[15] Hwang JH，Kim IG，Piao S，et al. Combination therapy of human adipose-derived stem cells and basic fibroblastgrowth factor hydrogel in muscle regeneration[J]. Biomaterials，2013，34（25）：6037-6045.

（收稿日期：2015-01-28）