馮亞男，王夢(mèng)麗，謝紅英，寧欣，陳芙蓉，張玉霞，徐小平

（四川大學(xué)華藥學(xué)院，四川成都610041）

HPLC法同時(shí)測(cè)定化妝品中多種生物還原劑

馮亞男，王夢(mèng)麗，謝紅英，寧欣，陳芙蓉，張玉霞，徐小平

（四川大學(xué)華藥學(xué)院，四川成都610041）

建立同時(shí)測(cè)定嫩膚-01（NF-01）中維生素C、綠原酸和咖啡酸等多個(gè)生物還原劑的HPLC測(cè)定法。采用ODS（4.6mm×150mm×5μm）為色譜柱，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%磷酸，進(jìn)行梯度洗脫（A相0min→5min，0→0；5min→15min，0→30%；15min→30 min，30%→30%）；檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；流量為1mL/min。維生素C、綠原酸和咖啡酸在質(zhì)量濃度43.5～636.0μg/mL，4.2～66.4μg/mL和4.3～68.8μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好（線性方程分別為y=2 871.4x+ 1221.7，r=0.9995；y=45 240x+1089.5，r=0.999 4和y=103271x+41823，r=0.9999）；連續(xù)3周考察溶液的穩(wěn)定性，3個(gè)組份在1d內(nèi)穩(wěn)定，在6 d內(nèi)基本穩(wěn)定，在3周后出現(xiàn)較明顯的變化。所建立的HPLC法能同時(shí)分離并定量該護(hù)膚品中極性差異較大的3種生物還原劑，可用于化妝品中類似配方的質(zhì)量控制。

維生素C；綠原酸；咖啡酸；HPLC

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

儀器：LC-2010高效液相色譜儀（日本島津儀器公司）；品成純水器（成都品成科技有限公司）；KL 10260D超聲清洗器；BT 125D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；漩渦震蕩器。

試藥：維生素C、綠原酸和咖啡酸對(duì)照品均購(gòu)于中檢所；NF-01嫩膚水（自制）；甲醇為色譜純（天津市科密化學(xué)試劑有限公司）；磷酸為分析純（重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司）；超純水（自制）。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取維生素C對(duì)照品87.0mg，綠原酸對(duì)照品8.3mg，咖啡酸對(duì)照品8.6mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液2mL，置于10mL容量瓶，加水稀釋定容，搖勻即得。

1.2.2 供試品溶液

精密量取供試品1mL，置于10mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻后精密量取2mL于10mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得。

1.3 色譜條件的篩選

1.3.1 梯度程序的篩選

流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：0.1%甲酸；分別在3種不同梯度程序下對(duì)化妝品進(jìn)行了測(cè)定，梯度程序見表1（A+B=100%）；色譜測(cè)定結(jié)果見圖1。

1.3.2 不同酸的篩選

在流動(dòng)相B分別為0.1%甲酸、0.1%磷酸、0.1%乙酸、水時(shí)，測(cè)定化妝品，結(jié)果見圖2。

1.3.3 波長(zhǎng)的篩選

維生素C、綠原酸、咖啡酸分別在波長(zhǎng)為240， 270，290，323nm對(duì)化妝品進(jìn)行了測(cè)定，最大吸收波長(zhǎng)分別為245，324，323nm，結(jié)果見圖3。

表1 3種不同梯度條件

圖1 不同梯度程序?qū)Ρ酒贩蛛x的影響HPLC圖

圖2 不同酸對(duì)本品HPLC分離的影響

圖3 不同波長(zhǎng)的本品HPLC圖

1.4 色譜條件

色譜柱：Sepax GP-C18（4.6mm×150mm×5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm；流量：1mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25℃；采用梯度洗脫法，流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：0.1%磷酸；梯度洗脫程序：A相0%，保持5min，15min升至30%，保持到30min；色譜圖見圖4。

1.5 方法學(xué)考查

1.5.1 線性、檢出限和定量限

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別置于10mL容量瓶中，加水稀釋制成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。分別以各自的質(zhì)量濃度與峰面積回歸計(jì)算3個(gè)組份的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)，以信噪比＞3為檢測(cè)限，信噪比＞10為定量限，結(jié)果見表2，VC、綠原酸和咖啡酸分別在43.5～636.0μg/mL，4.2～66.4μg/mL，4.3～68.8μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表2 維生素C、綠原酸、咖啡酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

1.5.2 精密度

取對(duì)照品溶液，按1.4下條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，以維生素C、綠原酸、咖啡酸各自的峰面積計(jì)算進(jìn)樣精密度分別為1.05%、1.57%、0.64%。取同一批樣品6份，按1.2.2制成供試品溶液，按外標(biāo)法測(cè)定被測(cè)組分含量，以VC、綠原酸、咖啡酸的含量計(jì)算各自的重復(fù)性精密度分別為1.79%、1.80%、0.85%。分別于6d，按外標(biāo)法每天測(cè)定同一批樣品的含量，VC、綠原酸，咖啡酸各自的日間精密度分別為0.42%、0.75%、0.69%。

1.5.3 加樣回收

精密量取已知量的供試品溶液適量，用水稀釋10倍作為背景溶液，精密量取9份1mL背景溶液，分別加入適量對(duì)照品儲(chǔ)備液，加水稀釋制成高中低3個(gè)質(zhì)量濃度各3份，精密量取各溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算各自含量，經(jīng)扣除背景后與加入的對(duì)照品量進(jìn)行比較，計(jì)算出各自的回收率，結(jié)果見表3。

1.6 NF-01的穩(wěn)定性考察

介于生物還原劑穩(wěn)定性較差的特點(diǎn)，本文針對(duì)化妝品溶液進(jìn)行了3周的穩(wěn)定性考察，其中第1d分別每小時(shí)采樣一次，檢測(cè)了12h，然后在第1周的每天采樣一次，檢測(cè)了6 d，之后的第1個(gè)月的每周采樣一次，檢測(cè)了3周，對(duì)同一供試品進(jìn)行含量測(cè)定，考查穩(wěn)定性。結(jié)果表明：維C、綠原酸、咖啡酸12h內(nèi)的最大變化率分別為：0.3%，0.4%，0.3%；6 d的最大變化率分別為3.7%，5.6%，3.3%；3周的最大變化率分別為15.4%，13.8%，5.3%。3組分在3周后都出現(xiàn)了較大的變化，變化率見圖5。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

圖5 20d內(nèi)穩(wěn)定性考察含量變化圖

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

維C、綠原酸和咖啡酸在質(zhì)量濃度范圍分別為43.5～636.0μg/mL，4.2～66.4μg/mL，4.3～68.8μg/mL，線性關(guān)系良好；檢出限分別為0.044，0.004，0.004μg/mL，定量限分別為0.218，0.021，0.022μg/mL。進(jìn)樣精密度分別為1.05%，1.57%，0.64%，重復(fù)性精密度分別為1.79%，1.80%，0.85%，日間精密度分別為0.42%，0.75%，0.69%，其精密度均小于2%，符合要求。加樣回收試驗(yàn)中，3者的平均回收率分別為99.80%，100.1%，100.3%，均在要求的98.0%～102.0%范圍內(nèi)；其RSD分別為0.98%、0.61%和0.35%，3者均小于2.0%；該方法具良好的準(zhǔn)確度。綜上，該實(shí)驗(yàn)條件具有良好的方法學(xué)特性，可以用來測(cè)定護(hù)膚品中還原劑成分的含量。

對(duì)化妝品進(jìn)行穩(wěn)定性考察，維C、綠原酸、咖啡酸12 h內(nèi)的最大變化率分別為：0.3%，0.4%，0.3%； 6 d的最大變化率分別為3.7%，5.6%，3.3%；3周的最大變化率分別為15.4%，13.8%，5.3%。結(jié)果表明3者的含量在3周后均出現(xiàn)了較大的變化，由圖5可知3者中咖啡酸的變化最緩，而維C的變化最快，這與維C易氧化特性具一定的關(guān)系。后期可考慮成分中加入適宜的抗氧劑，使之更為穩(wěn)定。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件對(duì)分離的影響

2.2.1 梯度對(duì)分離的影響

由3種梯度程序所得的色譜圖（見圖1），可以得知，甲醇開始加入的時(shí)間越早，維C出峰的時(shí)間越早，而流動(dòng)相中甲醇比例越大，綠原酸和咖啡酸出峰也就越早，為避免維C出峰過早，最終選擇在5min時(shí)開始加入甲醇，而在此條件下，綠原酸和咖啡酸的分離效能也較高。

2.2.2 不同酸對(duì)分離的影響

由于測(cè)定的3種物質(zhì)都是偏酸性的物質(zhì)，所以認(rèn)為在酸性條件下，3種物質(zhì)能夠更好地游離出來，所以考察了在流動(dòng)相B分別為0.1%甲酸、0.1%磷酸、0.1%乙酸和水時(shí)，色譜峰的分離情況。由圖2可知，在水和0.1%乙酸條件下綠原酸不出峰，且咖啡酸的柱效較低，而在酸性更大的0.1%甲酸和0.1%磷酸條件下，3種物質(zhì)均出峰，且能良好分離，而0.1%磷酸具有更好的分離效能，且pH在2～8之間，所以最終選擇了0.1%磷酸作為流動(dòng)相B。

2.3 波長(zhǎng)對(duì)檢測(cè)的影響

維生素C、綠原酸、咖啡酸的最大吸收波長(zhǎng)分別在245，324，323nm左右，分別在4個(gè)波長(zhǎng)處對(duì)化妝品進(jìn)行了測(cè)定。由圖3可知，在240nm時(shí)維C的響應(yīng)太高，而323 nm時(shí)維C的響應(yīng)又太低，所以選擇了兩個(gè)中間波長(zhǎng)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)270nm時(shí)綠原酸和咖啡酸的響應(yīng)太小而維C響應(yīng)又過高，而323nm和290 nm時(shí)綠原酸和咖啡酸響應(yīng)差異不大，而在290 nm時(shí)，維C能有更高的響應(yīng)，所以最終選擇290 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3 結(jié)束語

本文分別探索了不同波長(zhǎng)、酸以及梯度程序?qū)瘖y品中3種生物還原劑測(cè)定的影響，從而建立了1種較優(yōu)的HPLC梯度洗脫法使之能同時(shí)定量測(cè)定樣品中極性差異較大的3種生物還原劑。連續(xù)3周溶液的穩(wěn)定性考察，3個(gè)組份在1d內(nèi)穩(wěn)定，在6 d內(nèi)基本穩(wěn)定，在3周后出現(xiàn)較明顯的變化，為后期的配方優(yōu)化提供了有利條件。此方法簡(jiǎn)便靈敏，可用于化妝品中類似配方的質(zhì)量控制，并為化妝品的現(xiàn)代化質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

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Determ ination of bio-reductive agents in NF-01 by HPLC

FENG Ya’nan，WANG Mengli，XIE Hongying，NING Xin，CHEN Furong，ZHANG Yuxia，XU Xiaoping
（West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

A HPLC measurement has been established to simultaneously determine the vitamin C，chlorogenic acid and caffeic acid in NF-01.The method comprises the following steps:conduct gradient elution on a ODS column（4.6mm×150mm×5μm），along with the mobile phase A-methanol and the mobile phase B-0.1%phosphate（phase A：0 min→5 min，0→0；5 min→15 min，0→30%；15min→30min，30%→30%）；set the wavelength as 290nm and the flow rate as 1ml/min. The calibration curves of the vitamin C，the chlorogenic acid and the caffeic acid were linear in the ranges of 43.5-636.0μg/mL，4.2-66.4μg/mL and 4.3-68.8μg/mL respectively（y=2871.4x+1 221.7，r=0.999 5；y=45 240x+1 089.5，r=0.999 4；y=10 3271x+41 823，r=0.999 9）.After three consecutive weeks’observation on the stability of the solution，the above three components remains stable within a day，basically stable within 6 days，and changed significantly after 3 weeks.The established HPLC method can simultaneously determinate three bio-reductive agents of large polarity difference in NF-01 and can also control the quality of similar cosmetic formulations.

vitamin C；chlorogenic acid；caffeic acid；HPLC

A文章編號(hào)：1674-5124（2015）06-0052-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.06.012

0 引言

隨著人們對(duì)皮膚的日益重視，美白嫩膚類化妝品倍受青睞，最為常見的有維生素類[1]和植物多酚類[2]。這些生物還原劑無論是天然的還是合成的對(duì)皮膚表面的色斑和損傷都表現(xiàn)出較好的祛斑和修復(fù)作用，成為化妝品中常用的添加劑[3]。維生素C、E，茶多酚、咖啡酸和綠原酸等，更是藥物化妝品質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。然而這些共存的生物還原劑由于結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的差異較大，加之含量較低以及賦形劑的干擾，使得定量檢測(cè)較為困難，特別是同時(shí)檢測(cè)這些組分更加困難。有關(guān)這些組分的單一檢測(cè)方法已有不少報(bào)道，如容量法[4]、紫外光譜法[5]、HPLC法[6-9]、紅外光譜法[10-11]、電泳法[12]等。但是在化妝品中同時(shí)檢測(cè)這3種不同性質(zhì)的生物還原劑尚未見報(bào)道。本文建立了同時(shí)測(cè)定化妝品VC、綠原酸和咖啡酸的HPLC分析法，為護(hù)膚品多指標(biāo)質(zhì)量控制以及穩(wěn)定性研究提供了較為可行的分析方法。

2015-01-29；

2015-03-18

馮亞男（1991-），女，四川成都市人，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量控制。